Методы изучения клетки путем центрифугирования. Центрифугирование в цитологии

Главная

Биогафии

Дифференциальное центрифугирование
Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса .
В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при задан
ие
ной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5-10 мин при 3000- 5000 g приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000-50 000 g в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 g в течение 1 ч.
Зональное центрифугирование
Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем); большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 g в течение 1-4 ч.
Равновесное центрифугирование в градиенте плотности
При этом виде центрифугирования частицы разделяются по плавучей плотности, а не по скорости седиментации. Метод широко применяется для разделения различных фракций мембран, так как фрагменты мембран, относящиеся к одному и тому же типу, могут сильно различаться по размеру (и, следовательно, скорости седиментации), но должны иметь одинаковую плавучую плотность. Исследуемые компоненты движутся при цент-рифугировании в градиенте плотности растворенного вещества (для мембран и органелл с плотностью ниже
г/мл обычно используются сахарозные градиенты, а для более плотных структур, таких, как вирусы, применяют соли винной кислоты и хлористый цезий) до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное положение, при котором плотность каждой частицы равна плотности окружающего раствора. Поскольку растворы сахарозы относительно вязкие, градиенты, как правило, фор-мируют заранее. У растворов хлористого цезия вязкость низкая, так что трудно заранее приготовить его градиентный раствор; в этом случае применяют технику изопикнического центрифугирования в градиенте плотности. Пробу смешивают с хлористым цезием в количестве, достаточном для создания плотности, равной средней плотности субклеточных частиц. Эту гомогенную смесь помещают в сосуд для центрифугирования, и в результате седиментации хлористого цезия в поле центробежных сил при центрифугировании формируется его градиент.
Поскольку скорость седиментации частицы постепенно снижается по мере достижения ею той области градиента, где она имеет плотность одинаковую с плотностью раствора, для достижения равновесия центрифугировать требуется очень долго. Это особенно важно для маленьких мембранных везикул, таких, как хроматофори, или для фрагментов цитоплазматических мем-бран клеток, разрушенных на прессе Френча, так как скорость седиментации этих частиц низка даже в отсутствие градиента. Если применять центробежные ускорения порядка 100 000-200 000 g, для более или менее хорошего разделения требуется не меньше 24 ч, а для полного - 72 ч.
Градиенты сахарозы
Концентрация сахарозы в растворах для приготовления градиентов указывается в литературе по-разному: в единицах плотности, в молях сахарозы, в весовых процентах сахарозы (вес/вес), в процентах на единицу объема (вес/объем или г/100 мл). В стандартных химических справочниках есть таблицы для перевода концентраций водных растворов сахарозы из одних единиц в другие. Чаще всего используются весовые проценты са-харозы. При приготовлении сахарозных растворов плотность воды или разбавленных буферов принимают равной 1 г/мл. Следовательно, чтобы приготовить, например, раствор 54%-ной (вес/вес) сахарозы, нужно растворить 54 г сахарозы в 46 мл воды. При этом образуется 100 г раствора, а поскольку плотность 54%-ного (вес/вес) раствора сахарозы равна 1,2451, конечный объем будет 80,3 мл. Приготовление растворов таким путем устраняет необходимость доведения вязких растворов до фиксированных величин объема.
Для создания градиентов промышленностью выпускаются разнообразные устройства, но их применение не обязательно, так как удовлетворительные по качеству градиенты можно приготовить, наслоив друг на друга в центрифужном стакане ряд сахарозных растворов и выдержав в течение ночи, чтобы за счет диффузии образовался непрерывный градиент. Нет необходимости выдерживать градиенты, которые будут центрифугироваться 24 ч и больше, так как за время центрифугирования благодаря диффузии сформируется непрерывный градиент. Мы обычно готовим градиенты из пяти-семи слоев. Когда используются смачиваемые центрифужные стаканы, например, из нитроцеллюлозы или поликарбоната, слои можно наносить, давая им стекать вниз по стенке стакана из пипетки, которую держат под углом к стенке. Если берут несмачиваемые стаканы, такие, как полиалломерные или полипропиленовые, то кончик пипетки при добавлении раствора должен находиться в контакте с мениском, чтобы не происходило перемешивания.
Самый простой метод отбора фракций из сахарозных градиентов заключается в их выкачивании с по-мощью перистальтического насоса. Центрифужный стакан зажимают в круглых лапках (мы применяем кусок прозрачного плекса с просверленным по диаметру стакана отверстием, который зажимаем в лапках), а над ним в круглых лапках закрепляют трубочку небольшого диаметра из нержавеющей стали. Трубочку подсоединяют к насосу и опускают в стакан до соприкосновения с дном. Затем градиентный столбик с помощью насоса раскапывают по находящимся в коллекторе фракций мерным пробиркам.
Детергенты
Детергенты применяются при фракционировании клеток в трех случаях. Когда хотят получить немембранные органеллы, такие, как рибосомы, нуклеоиды и т. д., детергенты обеспечивают мягкое лизирование клеток после нарушения целостности муреина (грамположи- тельные бактерии) или наружной мембраны (грамотри- цательные бактерии). Детергенты применяют также для того, чтобы избирательно перевести в раствор цитоплазматическую мембрану грамотрицательных бактерий, сохранив интактной наружную мембрану, или удалить мембранные загрязнения с рибосом, полисом и стенок грамположительных клеток.
Детергенты представляют собой амфипатические молекулы, т. е. молекулы, имеющие как гидрофильную, так и гидрофобную области; они умеренно растворяются в воде. В очень низких концентрациях детергенты образуют в воде истинный раствор. По мере возраста-ния концентрации молекулы детергента агрегируют с образованием мицелл, в каждой из которых гидрофильные области обращены к воде, а гидрофобные скрыты от воды внутри мицеллы. Концентрацию, при которой по мере добавления детергента к воде начинают образовываться мицеллы, называют критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Каждый детергент характеризуется своими ККМ, размерами и формой ми-целл. Превосходный обзор Хелениуса и Симонса суммирует свойства многих детергентов, применяемых для получения клеточных фракций.
Детергенты можно подразделить на три класса, различающиеся по свойствам мицелл, способности связываться с белками и способности взаимодействовать с другими растворенными веществами. К этим классам относятся ионные детергенты, неионные детергенты и соли желчных кислот. С каждым детергентом связаны свои трудности и свои преимущества при фракционировании клеток.
Ионные детергенты
К самым распространенным ионным детергентам относятся додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия, ДСН), N-лаурилсаркозинат натрия (саркозил), алкил- бензосульфонаты (обычные, применяемые в домашнем хозяйстве детергенты) и соли четвертичных аминов, такие, как бромид цетилтриметиламмония (цетавлон). Ионные детергенты склонны образовывать небольшие мицеллы (с мол. массой - 10 ООО) и имеют относительно высокую ккм (для ДСН ККМ при комнатной температуре в разведенных буферах составляет примерно 0,2%). На ККМ и растворимость ионных детергентов сильно влияют ионная сила раствора и природа присутствующих в нем противоионов. К примеру, 10%-ный раствор ДСН теряет стабильность при температуре около 17 °С, в то время как сходный раствор додецилсуль- фата в трисе стабилен при 0°С. Додецилсульфат калия растворим только при повышенных температурах, и поэтому при использовании этого детергента К+ следует исключать из всех буферов.
Такие детергенты, как ДСН, которые имеют сильно ионизированную гидрофильную группу, не подвержены влиянию изменения реакции среды в широком диапазоне pH и не осаждаются 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Ионные детергенты сильно связываются с белками, и в случае ДСН обычно происходит разворачивание и необратимая денатурация белковых молекул. Хотя ионные детергенты можно удалить диализом, как правило, этого не делают из-за значительного связывания их с белками.
Неионные детергенты
К неионным детергентам относятся тритон Х-100, нонидет Р-40 (NP-40), твин 80 и октилглюкозид. Обычно мицеллы этих детергентов обладают большой моле-кулярной массой (50 000 и больше) и низкой ККМ (0,1% и ниже), что ограничивает их применимость при гель-фильтрации или гель-электрофорезе. На свойства этих детергентов в растворе почти не влияют реакция среды и ионная сила, хотя они могут осаждаться 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Неионные детергенты связываются только с гидрофобными белками и, как правило, не вызывают денатурации или потери биологической активности.
Соли желчных кислот
Соли желчных кислот представляют собой соли сте- риновых производных, например холат, дезоксихолат или таурохолат натрия. Из-за того что массивные стери- новые ядра плохо упаковываются, эти детергенты образуют небольшие мицеллы (часто всего из нескольких молекул), а молекулярная масса последних в отличие от других детергентов является функцией концентрации детергента. Поскольку эти детергенты - соли очень плохо растворимых кислот со значениями рКа в области 6,5-7,5, их следует использовать в щелочных диапазонах значений pH. Чтобы избежать трудностей с растворением, применяют концентрированные исходные растворы, которые готовят, растворяя в избытке NaOH соответствующую свободную кислоту. При работе с этими детергентами ионный состав, значение pH и общая концентрация детергента должны поддерживаться на по-стоянном уровне.
Проблемы,
возникающие при использовании детергентов
Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент: белок или детер-гент: липид значительно важнее истинной концентрации детергента. Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2-4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2%-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5-10 мг/мл.
Тритон Х-100, один из самых ценных неионных детергентов, создает трудности при измерениях количества белка, поскольку он содержит ароматический остаток, препятствующий измерению поглощения при 280 нм, а в пробах с участием химических реагентов образует мутный осадок. Мы обычно преодолеваем эту трудность с помощью мечения культуры небольшим количеством 3Н-лейцина. Если метка вводится в минимальную или синтетическую солевую среду, следует позаботиться о том, чтобы добавить туда достаточное количество немеченого лейцина, обеспечив тем самым постоянное в течение всего периода роста включение изотопа из расчета на 1 мг белка. Для Е. coliдостаточно добавить в качестве носителя 20-40 мкг немеченого лейцина, чтобы достичь равномерного включения метки. Когда ввести метку по каким-либо соображениям невозможно, содержание белка измеряют и в присутствии тритона Х-100 модифицированным методом Лоури, описанным в работе [П]. в соответствии с которым к пробе добавляют избыток ДСН. Последний образует стабильные смешанные мицеллы с тритоном, не мешающие измерениям.
Тритон Х-100 и другие сходные с ним неионные детергенты растворяются в водно-спиртовых смесях, а белки из таких смесей можно выделить осаждением в этаноле. Пробу помещают на лед и к ней добавляют при перемешивании 2 объема охлажденного на льду абсолютного этанола. Смесь выдерживают в течение ночи в морозильнике и собирают осадок белка центрифугированием. Для эффективного осаждения требуется концентрация белка не меньше 0,2 мг/мл. Разбавленные растворы белка концентрируют в аппарате для ультрафильтрации фирмы Amicon с помощью фильтра РМ-30. Правда, следует иметь в виду, что при этом концентрируются также и мицеллы детергента.
ДСН удаляют из проб ацетоновым осаждением. Шесть объемов безводного ацетона добавляют к пробе при комнатной температуре, а выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок промывают несколько раз водно-ацетоновой смесью (б -1). Так как осадок часто оказывается воскообразным и с ним трудно работать, мы обычно диспергируем его в воде гомогенизатором Поттера, а затем лиофилизуем.
Электрофорез в полиакриламидном геле
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН представляет собой самый простой и самый эффективный способ выявления набора полипептидов, присутствующих в субклеточных фракциях. Этот метод сейчас во многих случаях заменяет ферментативный и химический анализ при установлении чистоты и гомогенности субклеточных фракций.
Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день.
Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью и движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта. К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задер-живаются за счет того, что гель обладает свойствами «сита». Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли . См. также разд. 26.5.1.
Разделяющий, или разгоняющий, гель содержит 11,5% акриламида, 0,2% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,375 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1 % ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель по- лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено- лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН.
Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5 % глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурация всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1-5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (3X0,75 мм) достаточно вносить 5-25 мкг белка. Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток.
Пока исследуемая смесь не вошла в разделяющий гель, устанавливается начальное напряжение, равное 50 В; затем напряжение повышают до 145 В на весь остаток пути. Для наилучшего разрешения температура геля должна быть 25 °С.
Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промы-вать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше- гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммойия. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет ~30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей - полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев.
Полосы могут быть также размазанными из-за присутствующих в пробе липидов и гликолипидов (распространенный случай - присутствие липополисахаридов). Липиды связывают значительную часть ДСН, и фактически их присутствие может привести к истощению ДСН, доступного для связывания с белками, мигрирующими в геле. Эту трудность преодолевают, увеличивая количество ДСН в верхнем электродном буфере до 1 % и выше.
Гели окрашивают по методу Фейербенкса и др. . При слабом покачивании гели вымачивают по 1 ч в каждом из следующих растворов: 1) 525 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 1,0 г кумасси ярко-синего и 1275 мл воды; 2) 210 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,1 г кумасси ярко-синего и 1590 мл воды; 3) 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,05 г кумасси ярко-синего и 1800 мл воды и 4) 10%-ная уксусная кислота. После полного обесцвечивания геля его вымачивают перед высушиванием в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 1 % глицерина.

Задание №1.

В основе разделения органоидов методом центрифугирования лежат их различия по

1. Строению и составу

2. Выполняемым функциям

3. Плотности и массе

4. Расположению в цитоплазме

Объяснение: при центрифугировании самые плотные (тяжелые) частицы опускаются вниз, то есть таким методом можно разделить органоиды по плотности и массе. Правильный ответ - 3.

Задание №2.

Что является структурно-функциональной единицей строения организмов всех царств?

1. ДНК

2. Ядро

3. Клетка

4. Хромосома

Объяснение: следую клеточной теории, структурно-функциональной единицей всего живого является клетка. Правильный ответ - 3.

Задание №3.

Какие вещества выполняют в клетке информационную функцию?

1. Нуклеиновые кислоты

2. Белки

3. АТФ

4. Сборка белка

Объяснение: как мы знаем, за информацию в клетке отвечают нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК). ДНК хранит генетическую информацию, а РНК способствует ее воспроизведению. Правильный ответ - 1.

Задание №4.

Какой процесс лежит в основе образования двух хроматид перед делением клетки?

1. Репликация ДНК

2. Транскрипция

3. Синтез РНК

4. Сборка белка

Объяснение: в основе образования двух хроматид лежит процесс репликации ДНК (синоним репликации - копирование). Правильный ответ - 1.

Задание №5.

Для каких организмов характерен хемосинтез?

1. Цианобактерий

2. Бактериофагов

3. Эукариот

4. Серобактерий

Объяснение: хемосинтез - процесс образования органических веществ из неорганических при помощи окисления химических веществ (как органических, так и неорганических). Хемотрофами могут быть только бактерии. Правильный ответ - 4.

Задание №6.

Какие животные имеют прямое постэмбриональное развитие?

1. Млекопитающие

2. Плоские черви

3. Земноводные

4. Бабочки

Объяснение: у насекомых различают развитие с полным и неполным превращением, у плоских червей тоже сложный цикл развития, земноводные развиваются через стадию головастика, а млекопитающие рождаются сразу похожими на взрослое животное. Правильный ответ - 1.

Задание №7.

Видовые признаки организмов сохраняются благодаря

1. Наследственности

2. Доминантности

3. Обмену веществ

4. Адаптации

Объяснение: видовые признаки сохраняются благодаря передаче данных признаков из поколения в поколение, то есть посредством наследственности. Правильный ответ - 1.

Задание №8.

У темноволосых родителей родилась светловолосая дочь. Определите генотип родителей, если известно, что темный цвет волос доминирует над светлым.

1. Аа х АА

2. Аа х Аа

3. Аа х аа

4. Аа х АА

Объяснение: такая ситуация возможна только если оба родителя гетерозиготны по этому признаку (Аа). В таком случае вероятность рождения светловолосого ребенка равна 25%. Правильный ответ - 2.

Задание №9.

Способность организмов приобретать новые признаки и свойства называют

1. Наследственностью

2. Саморегуляцией

3. Изменчивостью

4. Самовоспроизведением

Объяснение: как мы сказали в задании №7, наследственность отвечает за передачу признаков из поколения в поколение, а изменчивость способствует приобретению организмами новых признаков. Правильный ответ - 3.

Задание №10.

Микориза - это

2. Симбиоз мицелия с корнями растений

3. Болезнь растения, вызванная грибами

4. Гифы гриба, на которых развивается плодовое тело

Объяснение: микориза - это симбиоз гиф гриба и корней дерева. При этом дерево обеспечивается минеральными веществами, так как гриб разлагает органические вещества до неорганических, а гриб обеспечивается органическими веществами, так как дерево является фототрофом, то есть создает органические вещества из неорганических при помощи солнечного света. Правильный ответ - 2.

Задание №11.

На каком рисунке изображена клетка, которая не может делиться?

Объяснение: клетка, которая не может делиться изображена на рисунке 2, так как почти всю клетку занимает вакуоль, это говорит о том, что клетка уже достаточно старая, а старые клетки не делятся. Правильный ответ - 2.

Задание №12.

Зеленые водоросли относят к царству растений, так как они

1. В клетках содержат хлорофилл

2. Являются индикаторами загрязнения воды и почвы

3. Имеют клеточное строение

4. Выделяют в атмосферу углекислый газ в процессе дыхания

Объяснение: водоросли (не только зеленые) относят к растениям, так как они обладают рядом признаков, характерным растениям (неподвижны, автотрофны, имеют пигменты и т.д.), в том числе содержат хлорофилл. Правильный ответ - 1.

Задание №13.

Взрослая особь человеческой аскариды обитает в

1. Желудке

2. Надпочечниках

3. Кишечнике

4. Легких

Объяснение: рассмотрим жизненный цикл аскариды

Как видно из схемы - половозрелые взрослые особи обитают в кишечнике человека. Правильный ответ - 3.

Задание №14.

Обыкновенный дельфин, погружаясь в морские глубины, расходует кислород, который содержится в

1. Легких

2. Полостях тела

3. Воздушных мешках

4. Жабрах

Объяснение: дельфин является вторичноводным млекопитающим, то есть предки дельфина жили на суше. И, как и любое другое млекопитающее, в своей дыхательной системе имеет легкие, которыми и дышит. У него нет ни воздушных мешков (как у птиц), ни жабр (как у рыб) и в полостях тела воздух тоже не накапливается. Правильный ответ - 1.

Задание №15.

Ротовая полость человека выстлана тканью, в которой клетки

1. Соединены друг с другом отростками

2. Плотно прилегают друг к другу

3. Имеют поперечную исчерченность

4. Располагаются рыхло

Объяснение: ротовая полость человека выстлана многослойный неороговевающим эпителием. Одной из характеристик эпителия является очень низкое содержание межклеточного вещества, то есть клетки плотно прилегают друг к другу. Правильный ответ - 2.

Задание №16.

В сердце человека створчатые клапаны открываются в

1. Предсердия

2. Вену

3. Желудочки

4. Аорту

Объяснение: створчатые клапаны расположены в сердце между предсердиями и желудочками, поэтому и открываются они в желудочки. Правильный ответ - 3.

Задание №17.

Человеку, работа которого требует длительного напряжения зрения, необходимо дополнительно употреблять витамин

1. А

2. В

3. С

4. D

Объяснение: огромное значение для фоторецепции и для зрения в целом имеет нормальное содержание витамина А. Он содержится в различных окрашенных продуктах - моркови, перцах, а также в рыбе, яйцах, молоке, печени и др. Правильный ответ - 1.

Задание №18.

Гуморальная регуляция осуществляется с помощью

1. Нервных импульсов, возникающих в рецепторах

2. Веществ, образующихся в железах внутренней секреции

3. Белков, содержащихся в пище

4. Деятельности головного и спинного мозга

Объяснение: гуморальная, она же гормональная, регуляция осуществляется при помощи гормонов, циркулирующих в крови. Гормоны выделяются железами внутренней секреции. Правильный ответ - 2.

Задание №19.

После травмы головы у человека нарушилась координация движения из-за нарушения работы

1. Мозжечка

2. Переднего мозга

3. Среднего мозга

4. Продолговатого мозга

Объяснение: за координацию движений отвечает мозжечок, также он регулирует мышечный тонус, равновесие и отвечает за мышечную память. Правильный ответ - 1.

Задание №20.

Скрещиванию разных видов синиц, обитающих в пределах одного лесного массива, препятствует

1. Разных хромосомный набор

2. Различие потребляемых кормов

3. Нарушение светового режима

4. Отсутствие мест для гнездования

Объяснение: скрещивание разных видов (не только синиц) невозможно из-за различий в хромосомном наборе организмов. Правильный ответ - 1.

Задание №21.

Стабилизирующая форма естественного отбора способствует

1. Полному вытеснению редких рецессивных мутаций

2. Сохранению в популяции среднего значения признака

3. Формированию новых признаков

4. Увеличению внутривидового разнообразия

Объяснение: стабилизирующая форма естественного отбора сохраняет особей популяции со средним значением признака, выбраковывая организмы с отклонениями от нормы. Правильный ответ - 2.

Задание №22.

Копчиковая кость, аппендикс, остаток третьего века в углу глаза человека - это

1. Аналогичные органы

2. Гомологичные органы

3. Атавизмы

4. Рудименты

Объяснение: все перечисленные признаки - это органы, оставшиеся от предков и утратившие свои функции. Такие органы называют рудиментарными. Правильный ответ - 4.

Задание №23.

Какой критерий вида служит главным доказательством родства человеческих рас?

1. Морфологический

2. Географический

3. Генетический

4. Физиологический

Объяснение: сейчас, в основном, для доказательства родства организмов или определения принадлежности к определенной группе, использую различные генетические методы. И, в зависимости от процентного соотношения гомологичности ДНК, определяют родство. Так доказали и родство человеческих рас. Правильный ответ - 3.

Задание №24.

Отношения каких организмов служат примером симбиоза?

1. Клеща и собаки

2. Сосны и масленка

3. Щуки и карася

4. Растения росянки и насекомого

Задание №25.

Роль организмов-консументов в экосистеме состоит в

1. Установлении симбиоза с растениями

2. Использовании ими солнечной энергии

3. Использовании неорганических веществ

4. Преобразовании органического вещества

Объяснение: консументы является вторым звеном в пищевой цепи после продуцентов (они превращают неорганические вещества в органические), то используют созданные продуцентами органические вещества. Правильный ответ - 4.

Задание №26.

Образование залежей каменного угля в недрах Земли связано преимущественно с развитием древних

1. Водорослей

2. Покрытосеменных

3. Моховидных

4. Папоротникообразных

Объяснение: залежи каменного угля образовались из остатков разложения различных древних растений, в основном, папоротникообразных. Правильный ответ - 4.

Задание №27.

Четвертичная структура молекулы гемоглобина представляет собой

1. Глобулу из одной полипептидной цепи

2. Двойную полипептидную спираль

3. Несколько соединенных полипептидных цепей

4. Последовательность аминокислот в полипептидной цепи

Объяснение: чтобы представить четвертичную структуру, посмотрим на картинку

Как мы видим, четвертичная структура представляет собой несколько свернутых полипептидных цепочек, они могут быть соединены ионом металла (например, гемоглобин). Правильный ответ - 3.

Задание №28.

Каковы конечные продукты подготовительного этапа энергетического обмена?

1. Углекислый газ и вода

2. Мочевина и мочевая кислота

3. Триглицериды и аммиак

4. Аминокислоты и глюкоза

Объяснение: на подготовительном этапе энергетического обмена происходит расщепление сложных органических молекул - полимеров до мономером, то есть белки расщепляются до аминокислот, полисахариды до моносахаридов и т.д. Вся полученная при этом энергия рассеивается в виде тепла. Правильный ответ - 4.

Задание №29.

Анализ стадий эмбриогенеза позвоночных животных служит основой для изучения их

1. Особенностей размножения

2. Уровня обмена веществ

3. Модификационной изменчивости

4. Эволюционного происхождения

Объяснение: биогенетический закон гласит: онтогенез - повторение филогенеза, то есть в процессе развития (эмбрионального) организм повторяет все этапы эволюции, через которые проходили его предки. Правильный ответ - 4.

Задание №30.

Ускорение роста культурных растений и увеличение их биомассы за счет регулярного полива и подкормки - это изменчивость

1. Мутационная

2. Соотносительная

3. Модификационная

4. Комбинативная

Объяснение: это изменчивость, которая возникает у конкретного организма в конкретных условиях, при этом признаки не передаются потомству. Правильный ответ - 3.

Задание №31.

Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору, получают в селекции растений путем

1. Гетерозиса

2. Близкородственного скрещивания

3. Искусственного отбора

4. Искусственного мутагенеза

Объяснение: речь идет о получении полиплоидных организмов, то есть с увеличенным набором хромосом. Такой набор можно получить только при помощи искусственного мутагенеза. Правильный ответ - 4.

Задание №32.

Лишайники, в отличие от мхов,

1. Образуют ризоиды

2. Являются комплексными организмами

3. Вступают в симбиоз с корнями высших растений

4. Размножаются спорами

Объяснение: мхи - высшие растения, лишайники - симбиоз гриба и водоросли, то есть комплексные организмы. Правильный ответ - 2.

Задание №33.

Кровь по кровеносным сосудам человека течёт

1. Прерывисто - в соответствии с прерывистой работой желудочка

2. Толчками - вследствие пульсации сосудов

3. Прерывисто - вследствие задержки ее в органах

4. Непрерывно - вследствие эластичности стенок крупных артерий

Объяснение: сердце сокращается периодически, но за счет эластичности сосудов кровь в организме циркулирует непрерывно. Правильный ответ - 4.

Задание №34.

Что характерно для внешнего торможения рефлексов?

1. Формируется в нейронах вегетативной нервной системы

2. Образуется под влиянием условного раздражителя

3. Появляется при возникновении сильного раздражителя

4. Не развивается в нейронах функционирующей рефлекторной дуги

Объяснение: внешнее торможение - это торможение, возникающее под действием какого-то сильного внешнего раздражителя (например, боль, звук и т.д.). Правильный ответ - 3.

Задание №35.

Наиболее существенные и постоянные преобразования в биосфере вызывают

1. Климатические условия

2. Природные катаклизмы

3. Сезонные изменения в природе

4. Живые организмы

Объяснение: абиотические факторы постоянно влияют на нашу планету. В вопросе речь идет о биосфере, то есть о живой оболочке Земли, изменения в которой возникают из-за воздействия живых организмов друг на друга и на оболочку Земли. Правильный ответ - 4.

Задание №36.

Верны ли следующие суждения об обмене веществ?

А. Пластический обмен представляет собой совокупность реакций расщепления органических веществ в клетке, сопровождающихся выделением энергии.

Б. Хлорофилл растительных клеток улавливает солнечную энергию, которая аккумулируется в молекулах АТФ.

1. Верно только А

2. Верно только Б

3. Верны оба суждения

4. Оба суждения неверны

Объяснение: пластический обмен - процесс образование сложных молекул из простых (полимеров из мономеров). То есть процесс, обратный расщеплению. А второе утверждение верно. Правильный ответ - 2.

Задание №37.

Какие особенности строения и свойств воды определяют её функции в клетке?

1. Способность образовывать водородные связи

2. Наличие в молекулах макроэргических связей

3. Полярность молекулы

4. Высокая теплоемкость

5. Способность образовывать ионные связи

6. Способность выделять энергию при расщеплении

Объяснение: молекула воды полярная, между молекулами воды образуются водородные связи и она является внутренней средой организма и всех клеток, в которой происходят все реакции обмена, так же она является растворителем для большинства веществ. Таким образом, выбираем - 1, 3, 4.

Задание №38.

Какую функцию выполняют вставочные нейроны в нервной системе человека?

1. Передают нервные импульсы с двигательного нейрона в головной мозг

2. Передают нервные импульсы от рабочего органа в спинной мозг

3. Передают импульсы от спинного в головной мозг

4. Передают нервные импульсы к рабочим органам

5. Воспринимают нервные импульсы от чувствительных нейронов

6. Передают нервные импульсы двигательным нейронам

Объяснение: самая простая рефлекторная дуга состоит из чувствительного, вставочного и двигательного нейронов. Вставочные нейроны воспринимают импульс от чувствительных нейронов, передают сигнал из спинного мозга в головной и передают импульс к двигательным нейронам. Правильный ответ - 1, 3, 4.

Задание №39.

Какие из перечисленных примеров относят к ароморфозам?

2. Появление кровеносной системы у кольчатых червей

3. Возникновение теплокровности у млекопитающих

4. Расположение пальцев у дятлов - два вперед и два назад

5. Развитие сосущего ротового аппарата у насекомых

6. Появление четырехкамерного сердца у птиц

Объяснение: напомним, что ароморфоз - это такое изменение организма, которое способствует повышению его уровня организации. То есть это должно быть качественное (глобальное) изменение, такое, например, как появление кровеносной системы у кольчатых червей, возникновение теплокровности и появление четырехкамерного сердца. Остальные изменения является не глобальными, а частными. Правильный ответ - 2, 3, 6.

Задание №40.

Установите соответствие между признаком организма и царством, для которого он характерен.

Признак организма Царство

А. ДНК замкнута в виде кольца 1. Грибы

Б. По способу питания - автотрофы или гетеротрофы 2. Бактерии

В. Клетки имеют оформленное ядро

Г. ДНК имеет линейное строение

Д. В клеточное стенке имеется хитин

Е. Ядерное вещество расположено в цитоплазме

Объяснение: вспоминаем, что грибы - эукариоты, а бактерии - прокариоты, соответственно у прокариот отсутствует ядерная оболочка и все мембранные органеллы, кольцевая ДНК, по типу питания они могут быть как гетеро- так и автотрофами. То есть, правильный ответ - 221112.

Задание №41.

Установите соответствие между железой в организме человека и ее типом.

Железа Тип железы

А. Молочная 1. Внутренней секреции

Б. Щитовидная 2. Внешней секреции

В. Печень

Г. Потовая

Д. Гипофиз

Е. Надпочечники

Объяснение: железы внутренней секреции выделяют гормоны, то есть это такие железы, как щитовидная, гипофиз и надпочечники. Правильный ответ - 212211.

Задание №42.

Установите соответствие между характеристикой особи и ее генотипом.

Характеристика особи Генотип

А. Не дает расщепления в потомстве 1. Гомозиготный

Б. Имеет оба доминантных аллельных гена 2. Гетерозиготный

В. В потомстве происходит расщепление признаков

Г. Генотип содержит альтернативные гены

Д. Имеет оба рецессивных аллельных гена

Е. Образует разные типы гамет

Объяснение: гомозиготный генотип не дает расщепления в потомстве, имеет оба доминантных аллеля, не содержит альтернативных генов, имеет оба рецессивных аллеля и образует один тип гамет. Правильный ответ - 112212.

Задание №43.

Установите соответствие между характеристикой экосистем и их типом.

Характеристика Тип экосистем

А. Преобладают растения одного вида 1. Природная экосистема

Б. Обитает большое разнообразие видов 2. Агроэкосистема

В. Осуществляется саморегуляция

численности популяций

Г. Круговорот веществ незамкнутый

Д. Большую роль играет антропогенный фактор

Е. Пищевые цепи длинные

Объяснение: агроэкосистема включает один или несколько видов растений, имеет незамкнутый круговорот веществ, короткие пищевые цепи и человек играет большую роль в его жизнедеятельности. Правильный ответ - 211221.

Задание №44.

Установите последовательность процессов, происходящих при фагоцитозе.

1. Поступление мономеров в цитоплазму

2. Захват клеточной мембраной питательных веществ

3. Гидролиз полимеров до мономеров

4. Образование фагоцитозного пузырька внутри клетки

5. Слияние фагоцитозного пузырька с лизосомой

Объяснение: фагоцитоз - поглощение частиц пищи. Начинается с захвата клеточной мембраной питательных веществ, затем образуется фагоцитарный пузырек внутри клетки, потом он сливается с лизосомой, в лизосоме происходит гидролиз полимеров до мономеров и, в итоге, мономеры выходят в цитоплазму. Правильный ответ - 24531.

Задание №45.

Объясните, почему сокращение численности волков из-за отстрела в биоценозах тундры приводит к уменьшению запасов ягеля - корма северных оленей.

Объяснение: это происходит, потому что волки охотятся на северных оленей. Чем меньше волков, тем большей оленей, а олени кушаю ягель. При неконтролируемом размножении северных оленей запасы ягеля резко сократятся.

Задание №46.

Определите класс цветкового растения, изображенного на рисунке. Обоснуйте Ваш ответ. Назовите органы, обозначенные на рисунке буквами А и Б, и объясните их роль в жизни растения.

Объяснение: на рисунке представлена земляника (семейство розоцветные, класс двудольные, отдел покрытосеменные - наличие цветка и плода - признак покрытосеменных). А - цветок (орган полового размножения. Б - ус (столон) - видоизмененный побег. Земляника может размножаться и вегетативно при помощи столонов.

Задание №47.

Где расположен центр безусловно-рефлекторной регуляции кровяного давления человека? Чем различаются показатели кровяного давления в аорте и половых венах? Ответ поясните.

Объяснение: центр рефлекторно-рефлекторной регуляции кровяного давления расположен в продолговатом мозге (вообще большинство безусловных рефлексов контролируется спинным мозгом). В аорте давление более высокое, так как аорта расположена в начале большого круга кровообращения, а полыми венами большой круг кровообращения заканчивается, поэтому давление здесь наиболее низкое.

Задание №48.

В природе осуществляется круговорот кислорода. Какую роль играют в этом процессе живые организмы?

Объяснение: живые организмы дышат кислородом (кислород окисляет глюкозу при клеточном дыхании), при этом образуются углекислый газ и вода. Растения фиксируют углекислый газ в цикле Кальвина и выделяют кислород при фотосинтезе в качестве побочного продукта. А некоторые бактерии, осуществляющие хемосинтез, могут использовать кислород для окисления химических веществ.

Задание №49.

В биосинтезе фрагмента молекулы белка участвовали последовательно молекулы тРНК с антикодонами АГЦ, ГЦЦ, УЦА, ЦГА, АГА. Определите аминокислотную последовательность синтезируемого фрагмента молекулы белка и нуклеотидную последовательность участка двухцепочечной молекулы ДНК, в которой закодирована информация о первичной структуре фрагмента белка. Объясните последовательность ваших действий.

Объяснение: нам дана последовательность тРНК, значит задачу мы будем решать с конца: сначала напишем комплементарную цепь иРНК, затем комплементарную двойную цепь ДНК.

тРНК: АГЦ ГЦЦ УЦА ЦГА АГА

иРНК: УЦГ ЦГГ АГУ ГЦУ УЦУ

ДНК1: АГЦ ГЦЦ ТЦА ЦГА АГА

ДНК2: ТЦГ ЦГГ АГТ ГЦТ ТЦТ

Задание №50.

При скрещивании пестрой хохлатой (В) курицы с таким же петухом было получено восемь цыплят: четыре цыпленка пестрых хохлатых, два - белых (а) хохлатых и два - черных хохлатых. Составьте схему решения задачи. Определите генотипы родителей и потомства, объясните характер наследования признаков и появление особей с пестрой окраской. Какие законы наследственности проявляются в данном случае?

Объяснение: такое расщепление возможно только если родители гетерозиготны по окраске, то есть пестрая окраска имеет генотип - Аа

АА - черная окраска

аа - белая окраска

Аа - пестрая окраска

P: АаВВ х АаВВ

G: АВ, аВ

F1: АаВВ - пестрый хохлатый (4 цыпленка)

ааВВ - белый хохлатый (два цыпленка)

ААВВ - черный хохлатый

По окраске расщепление по генотипу и фенотипу одинаковое: 1:2:1, так как здесь присутствует явление неполного доминирования (между и черной и белой окраской появляется промежуточный вариант), признаки наследуются независимо.

Метод замораживания-скалывания

Принципиально новые возможности электронной микроскопии открылись сравнительно недавно, после разработки метода «замораживания – скалывания». С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе.

При обычном замораживании в клетках образуются кристаллики льда, которые заметно искажают их структуру. Во избежание этого клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (-196С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций.

Замороженный блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода). Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. Однако весь фокус состоит в том, что напыление производится под углом к поверхности образца. Это очень важный момент. Появляется эффект тени, изображение выглядит объемным.

В трансмиссионном микроскопе электронный луч способен проникнуть только через очень тонкие срезы. Обычная толщина оттененных образцов чрезмерно велика, поэтому органическую материю, подстилающую слой металла, необходимо растворить. В результате остается тонкая металлическая реплика (или отпечаток) с поверхности образца. Реплику и используют в трансмиссионном микроскопе.

Этот метод предоставил, например, уникальную возможность наблюдать внутреннее строение мембран клетки.

Дифференциальное центрифугирование

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Принцип метода состоит в том, что при центрифугировании развивается центробежная сила, под воздействием которой взвешенные частицы оседают на дно центрифужной пробирки.

После того, как в начале 40-х годов начали использовать ультрацентрифугу, разделение клеточных компонентов стало вполне реальным.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить – разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

При высокоскоростном центрифугировании крупные компоненты клетки (например, ядра) быстро оседают (седиментируют), при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высоких скоростях в осадок выпадают более мелкие компоненты, такие как хлоропласты и митохондрии.

То есть при центрифугировании компоненты клетки распадаются на фракции: крупные и мелкие, поэтому второе название метода? фракционирование. При этом, чем выше скорость и длительность цетрифугирования, тем мельче полученная фракция.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Этапы дифференциального центрифугирования: низкая скорость (ядра, цитоскелет), средняя скорость (хлоропласты), высокая скорость (митохондрии, ризосомы, микротельца), очень высокая скорость (рибосомы).

Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов. Так, использование именно этого метода принесло триумфальный успех в изучении биосинтеза белка.

Ну и вообще, чистые фракции внутриклеточных структур можно подвергать любым видам анализа.

Метод культуры клеток

Клетки животных, выделенные в культуру (то есть помещенные на питательную среду), погибают после определенного числа делений, поэтому считаются трудным и неудобным объектом для культивирования. Другое дело клетки растений, способные делиться неограниченное число раз.

Метод культуры клеток облегчает изучение механизмов клеточной дифференциации у растений.

На питательной среде клетки растений образуют однородную недифференцированную клеточную массу- каллус. Каллус обрабатывают гормонами. Под влиянием гормонов клетки каллуса могут давать начало разным органам.

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить - разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Метод дифференциального центрифугирования

Суть метода:

1. Приготовление гомогената из исследуемых клеток;

2. Центрифугирование

3. Разделение фракций

Изучение фракций

Принцип метода – в разделении внутриклеточных компонентов на фракции, отличающиеся по массе при помощи высокоскоростной центрифуги.

При подготовке клеток к такому исследованию из клеток готовится гомогенат. Гомогенат – это клетки, которые подвергаются механическому разрушению до состояния взвеси из внутриклеточных структур. Полученные фракции, в дальнейшем можно изучать методами биохимического анализа или изучать морфологию этих структур.

Метод дифференциального центрифугирования рассматривался нами при изучении темы Вакуолярная система клетки, при открытии Де Дювом лизосом и др.

Центрифугирование – первый этап фракционирования, с его помощью разделяются толко достаточно крупные компоненты. Для достижения более высокой степени разделения клеточных компонентов далее используется метод седиментации в градиенте плотности. Эту разновидность метода мы рассматривали в теме, когда касались морфологии рибосом, их субъединиц и рРНК, которые дифференцировали по величине константы седиментации Сведберга.

Для фракционирования отдельных разновидностей белков в биохимии применяется метод хроматографии. В биологии часто используется метод распределительной хроматографии. Суть этого метода заключается в том, что каплю образца (содержащего биологическую жидкость) наносят на поверхность специальной бумаги (хроматография на бумаге) или на пластинку из стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента (целлюлозы или силикагеля) – хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография. Затем пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например воды и спирта). По мере движения растворителя вверх по пластинке его молекулы подхватывают те молекулы образца, которые растворяются. В результате происходит дифференциация молекул образца на хорошо и плохо растворимые, то есть те которые движутся быстро и медленно. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют на ней местоположение определенных молекул. Другая разновидность разгонки белков – колоночная хроматография. В этом случае смесь молекул образца пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с разной скоростью. Этот вид хроматографии, когда используются колонки, набитые крошечными пористыми шариками, находящимися в геле позволяют определить размер белковых молекул.

Биологическое применение

Разнообразные методы хроматографии используются в биологии, например для определения разницы в белках у близких видов (видов-двойников), для которых этот метод является вторым после достаточно трудоемкого кариологического анализа.

Суть этого метода в применении радиоактивных изотопов водорода (трития), серы, фосфора, кислорода и др. и их обнаружения в образце, в который они вводились.

Метод очень чувствительный, так как практически можно зарегистрировать каждый распад, то есть может быть учтен каждый радиоактивный атом.

Принцип метода:

В живую, функционирующую клетку вводятся радиоактивные предшественники, путем очень кратковременного (импульсного мечения). Они включаются в состав определенных клеточных структур. Затем из клеток готовятся микроскопические препараты, на поверхность которых наносится фотоэмульсия. После определенного времени экспозиции в результате радиоактивного распада происходит восстановление серебра фотоэмульсии альфа и бета частицами. После проявления фотоэмульсии, на поверхности препарата видны темные метки, в тех участках, в которые был включен радиоактивный предшественник.

Таким образом, можно наблюдать, как радиоактивная метка перемещается из одной клеточной структуры в другую. Так можно выяснить в каких внутриклеточных структурах может происходить синтез тех или иных веществ.

Если в клетки ввести меченый тритием тимидин, то можно изучать течение во времени процессов, связанных с обновлением (редупликацией ДНК, если в клетку ввести меченый тритием урацил, то можно изучать динамику процессов, связанных с синтезом разнообразных видов молекул РНК, (например, рРНК в ядрышке, иРНК – при транскрибции и т.д.).

Этот метод мы разбирали при изучении разделов об определении времени жизненного цикла клетки и доказательств полуконсервативности редубликации ДНК, при изучении механизма образования экспортного белка.

Период полураспада некоторых радиоактивных изотопов, применяющихся в биологии:

Р32 – 14 сут; J134 – 8.1 сут; S35 – 87 сут; C14 – 5 570 лет; Ca45 – 164 сут; H3 – 12,3 года.

Разделы