Твердофазный синтез. Твердофазный синтез пептидов с защитными группами вос и fmoc

В периодической системе водород располагается в двух абсолютно противоположных по своим свойствам группах элементов. Данная особенность делают его совершенно уникальным. Водород не просто представляет собой элемент или вещество, но также является составной частью многих сложных соединений, органогенным и биогенным элементом. Поэтому рассмотрим его свойства и характеристики более подробно.

Выделение горючего газа в процессе взаимодействия металлов и кислот наблюдали еще в XVI веке, то есть во время становления химии как науки. Известный английский ученый Генри Кавендиш исследовал вещество, начиная с 1766 года, и дал ему название «горючий воздух». При сжигании этот газ давал воду. К сожалению, приверженность ученого теории флогистона (гипотетической «сверхтонкой материи») помешала ему прийти к правильным выводам.

Французский химик и естествоиспытатель А. Лавуазье вместе с инженером Ж. Менье и при помощи специальных газометров в 1783 г. провел синтез воды, а после и ее анализ посредством разложения водяного пара раскаленным железом. Таким образом, ученые смогли прийти к правильным выводам. Они установили, что «горючий воздух» не только входит в состав воды, но и может быть получен из нее.

В 1787 году Лавуазье выдвинул предположение, что исследуемый газ является простым веществом и, соответственно, относится к числу первичных химических элементов. Он назвал его hydrogene (от греческих слов hydor - вода + gennao - рождаю), т. е. «рождающий воду».

Русское название «водород» в 1824 году предложил химик М. Соловьев. Определение состава воды ознаменовало конец «теории флогистона». На стыке XVIII и XIX веков было установлено, что атом водорода очень легкий (по сравнению с атомами прочих элементов) и его масса была принята за основную единицу сравнения атомных масс, получив значение, равное 1.

Физические свойства

Водород является легчайшим из всех известных науке веществ (он в 14,4 раз легче воздуха), его плотность составляет 0,0899 г/л (1 атм, 0 °С). Данный материал плавится (затвердевает) и кипит (сжижается), соответственно, при -259,1 °С и -252,8 °С (только гелий обладает более низкими t° кипения и плавления).

Критическая температура водорода крайне низка (-240 °С). По этой причине его сжижение - довольно сложный и затратный процесс. Критическое давление вещества - 12,8 кгс/см², а критическая плотность составляет 0,0312 г/см³. Среди всех газов водород имеет наибольшую теплопроводность: при 1 атм и 0 °С она равняется 0,174 вт/(мхК).

Удельная теплоемкость вещества в тех же условиях - 14,208 кДж/(кгхК) или 3,394 кал/(гх°С). Данный элемент слабо растворим в воде (около 0,0182 мл/г при 1 атм и 20 °С), но хорошо - в большинстве металлов (Ni, Pt, Pa и прочих), особенно в палладии (примерно 850 объемов на один объем Pd).

С последним свойством связана его способность диффундирования, при этом диффузия через углеродистый сплав (к примеру, сталь) может сопровождаться разрушением сплава из-за взаимодействия водорода с углеродом (этот процесс называется декарбонизация). В жидком состоянии вещество очень легкое (плотность - 0,0708 г/см³ при t° = -253 °С) и текучее (вязкость - 13,8 спуаз в тех же условиях).

Во многих соединениях этот элемент проявляет валентность +1 (степень окисления), подобно натрию и прочим щелочным металлам. Обычно он рассматривается в качестве аналога этих металлов. Соответственно он возглавляет I группу системы Менделеева. В гидридах металлов ион водорода проявляет отрицательный заряд (степень окисления при этом -1), то есть Na+H- имеет структуру, подобную хлориду Na+Cl-. В соответствии с этим и некоторыми другими фактами (близость физических свойств элемента «H» и галогенов, способность его замещения галогенами в органических соединениях) Hydrogene относят к VII группе системы Менделеева.

В обычных условиях молекулярный водород имеет низкую активность, непосредственно соединяясь только с самыми активными из неметаллов (с фтором и хлором, с последним - на свету). В свою очередь, при нагревании он взаимодействует со многими химическими элементами.

Атомарный водород имеет повышенную химическую активность (если сравнивать с молекулярным). С кислородом он образует воду по формуле:

Н₂ + ½О₂ = Н₂О,

выделяя 285,937 кДж/моль тепла или 68,3174 ккал/моль (25 °С, 1 атм). В обычных температурных условиях реакция протекает довольно медленно, а при t° >= 550 °С - неконтролируемо. Пределы взрывоопасности смеси водород + кислород по объему составляют 4–94 % Н₂, а смеси водород + воздух - 4–74 % Н₂ (смесь из двух объемов Н₂ и одного объема О₂ называют гремучим газом).

Данный элемент используют для восстановления большинства металлов, так как он отнимает кислород у оксидов:

Fe₃O₄ + 4H₂ = 3Fe + 4Н₂О,

CuO + H₂ = Cu + H₂O и т. д.

С разными галогенами водород образует галогеноводороды, к примеру:

Н₂ + Cl₂ = 2НСl.

Однако при реакции с фтором водород взрывается (это происходит и в темноте, при -252 °С), с бромом и хлором реагирует только при нагревании или освещении, а с йодом - исключительно при нагревании. При взаимодействии с азотом образуется аммиак, но лишь на катализаторе, при повышенных давлениях и температуре:

ЗН₂ + N₂ = 2NН₃.

При нагревании водород активно реагирует с серой:

Н₂ + S = H₂S (сероводород),

и значительно труднее - с теллуром или селеном. С чистым углеродом водород реагирует без катализатора, но при высоких температурах:

2Н₂ + С (аморфный) = СН₄ (метан).

Данное вещество непосредственно реагирует с некоторыми из металлов (щелочными, щелочноземельными и прочими), образуя гидриды, например:

Н₂ + 2Li = 2LiH.

Немаловажное практическое значение имеют взаимодействия водорода и оксида углерода (II). При этом в зависимости от давления, температуры и катализатора образуются разные органические соединения: НСНО, СН₃ОН и пр. Ненасыщенные углеводороды в процессе реакции переходят в насыщенные, к примеру:

С n Н₂ n + Н₂ = С n Н₂ n ₊₂.

Водород и его соединения играют в химии исключительную роль. Он обусловливает кислотные свойства т. н. протонных кислот, склонен образовывать с разными элементами водородную связь, оказывающую значительное влияние на свойства многих неорганических и органических соединений.

Получение водорода

Основными видами сырья для промышленного производства этого элемента являются газы нефтепереработки, природные горючие и коксовые газы. Его также получают из воды посредством электролиза (в местах с доступной электроэнергией). Одним из важнейших методов производства материала из природного газа считается каталитическое взаимодействие углеводородов, в основном метана, с водяным паром (т. н. конверсия). Например:

СН₄ + H₂О = СО + ЗН₂.

Неполное окисление углеводородов кислородом:

СН₄ + ½О₂ = СО + 2Н₂.

Синтезированный оксид углерода (II) подвергается конверсии:

СО + Н₂О = СО₂ + Н₂.

Водород, производимый из природного газа, является самым дешевым.

Для электролиза воды применяется постоянный ток, который пропускается через раствор NaOH или КОН (кислоты не используют во избежание коррозии аппаратуры). В лабораторных условиях материал получают электролизом воды или в результате реакции между соляной кислотой и цинком. Однако чаще применяют готовый заводской материал в баллонах.

Из газов нефтепереработки и коксового газа данный элемент выделяют путем удаления всех остальных компонентов газовой смеси, так как они легче сжижаются при глубоком охлаждении.

Промышленным образом этот материал стали получать еще в конце XVIII века. Тогда его использовали для наполнения воздушных шаров. На данный момент водород широко применяют в промышленности, главным образом - в химической, для производства аммиака.

Массовые потребители вещества - производители метилового и прочих спиртов, синтетического бензина и многих других продуктов. Их получают синтезом из оксида углерода (II) и водорода. Hydrogene используют для гидрогенизации тяжелого и твердого жидкого топлива, жиров и пр., для синтеза HCl, гидроочистки нефтепродуктов, а также в резке/сварке металлов. Важнейшими элементами для атомной энергетики являются его изотопы - тритий и дейтерий.

Биологическая роль водорода

Около 10 % массы живых организмов (в среднем) приходится на этот элемент. Он входит в состав воды и важнейших групп природных соединений, включая белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы. Для чего он служит?

Этот материал играет решающую роль: при поддержании пространственной структуры белков (четвертичной), в осуществлении принципа комплиментарности нуклеиновых кислот (т. е. в реализации и хранении генетической информации), вообще в «узнавании» на молекулярном уровне.

Ион водорода Н+ принимает участие в важных динамических реакциях/процессах в организме. В том числе: в биологическом окислении, которое обеспечивает живые клетки энергией, в реакциях биосинтеза, в фотосинтезе у растений, в бактериальном фотосинтезе и азотфиксации, в поддержании кислотно-щелочного баланса и гомеостаза, в мембранных процессах транспорта. Наряду с углеродом и кислородом он образует функциональную и структурную основы явлений жизни.

Твердофазный синтез основан на том, что первое звено будущего олигомера ковалентно закрепляется на "якорной" группе Н., наращивание цепи проводится стандартно защищенными мономерами по обычным схемам, используемым для синтеза в р-рах. На заключит. этапе синтезир. олигомер отщепляется от Н. и очищается соответствующими методами. Твердофазный синтез применяют в осн. для получения полипептидов , олиго-нуклеотидов и олигосахаридов .

При синтезе полипептидов в качестве Н. наиб. широко используют сополимер стирола и 1-2% дивинилбензола , модифицированный введением диметоксибензилхлоридной якорной группы для присоединения первой аминокислоты (с защищенной группой N H 2) по С-концу, напр.:

После удаления N-защитной группы наращивание полипептидной цепи проводят стандартными методами пептидного синтеза в р-ре (см. Пептиды). В качестве конденсирующих агентов наиб. часто используют карбодиимиды или предварительно превращают аминокислоты в активир. эфиры.

При синтезе олигонуклеотидов в качестве Н. используют макропористые стекла или силикагель . Якорной группой служит карбоксильная группа , отделенная от пов-сти Н. спец. "ножкой", напр.:

В-пуриновое или пиримидиковое основание

На первой стадии нуклеозид присоединяют к носителю по 3"-гидроксильной группе дезоксирибозы , у к-рой гидрок-сильная группа в положении 5" защищена диметокситри-тильной группой (СН 3 ОС 6 Н 4) 2 (С 6 Н 5)С (DMTr); кол-во последней после ее отщепления легко измеряется спектро-фотометрически, что служит количеств. характеристикой загрузки носителя и позволяет оценить выходы на последующих стадиях наращивания олигонуклеотидной цепи. После удаления группы DMTr сборку цепи осуществляют с помощью фосфитамидов (ф-ла I; M. Kapoзерс, 1980) или фосфонатов (гидрофосфонатов) (II; Р. Стремберг, 1986):

Для осуществления твердофазного синтеза необходимы высокие выходы (на уровне 96-99%) на каждой стадии р-ции, а также эффективные методы очистки и выделения синтезир. соединений.

Использование твердой фазы позволяет существенно упростить и ускорить проведение каждой стадии наращивания цепи олигомера , поскольку отделение избытка компонентов, конденсирующих агентов и побочных продуктов, находящихся в р-ре, достигается фильтрованием реакц. смеси и отмывкой Н. подходящим набором р-рите-лей. Т. обр., процесс сборки цепи олигомера распадается на ряд стандартных операций: деблокирование растущего конца цепи, дозирование очередного защищенного мономера и конденсирующего агента, подача этой смеси на колонку с Н. в течение рассчитанного времени и отмывка Н. подходящим р-рителем. Цикл наращивания мономерного звена м. б. автоматизирован.

В основе автоматич. пром. синтезаторов лежит общая принципиальная схема (см. рис.). Многочисл. модели синтезаторов различаются конструкцией колонок и их кол-вом, способом подачи реагентов и р-рителей и др. Управление и программирование осуществляют с помощью встроенного или вынесенного компьютера.

Принципиальная схема устройства автоматич. пром. синтезаторов (электрич. линия управления обозначена пунктиром): 1 -линия подачи мономеров (М 1 , М n) и конденсирующего агента (КА); 2-линия подачи реагентов (напр., окислителей , ацилирующих агентов, к-т и др.) и р-рителей (P 1 , Р n); 3 - переключающие клапаны; 4-колонка с носителем , снабженная распределит. клапаном; 5-фотометрич. ячейка; 6-измеритель; 7-блок управления и программирования; 8-дисплей.

Потенциальные возможности твердофазного синтеза были продемонстрированы синтезом рибонуклеазы А (Р. Меррифилд, 1969) и гормона роста человека (Д. Ямаширо, 1970) длиной 124 и 183 аминокислоты соответственно. Однако в связи с небольшой, но постоянной рацемизацией , происходящей при образовании пептидной связи , синтезир. белки обладают низкой биол . активностью , поэтому автоматич. синтезаторы используются гл. обр. для получения коротких полипептидов (10-30 звеньев), в т. ч. для препаративного

Твердофазный синтез или твердофазная технология, которую часто называют керамической, являются наиболее распространенными при получении неорганических материалов для различных отраслей науки и промышленности. К ним относятся ядерное топливо, материалы для космической техники, радиоэлектроники, приборостроения, катализаторы, огнеупоры, высокотемпературные сверхпроводники, полупроводники, сегнето- и пьезоэлектрики, магнетики, различные композиты и многие другие .

В основе твердофазного синтеза лежат химические реакции, в которых, по крайней мере, хотя бы один из реагентов находится в виде твердого вещества. Такие реакции называются гетерогенными или твердофазными. Твердофазное взаимодействие, в отличие от реакций в жидкой или газовой среде, складывается из двух фундаментальных процессов: из самой химической реакции и переноса вещества к реакционной зоне.

Твердофазные реакции с участием кристаллических компонентов характеризуются ограниченной подвижностью их атомов или ионов и сложной зависимостью от многих факторов. К ним относятся такие, как химическая структура и связанная с ней реакционная способность реагирующих твердых веществ, природа и концентрация дефектов, состояние поверхности и морфология реакционной зоны, площадь контакта взаимодействующих реагентов, предварительная механохимическая активация и ряд других. Все отмеченное обусловливает сложность механизмов гетерогенных реакций. Изучение гетерогенных реакций основывается на химии твердого тела, химической физике и физической химии поверхности твердых тел, на законах термодинамики и кинетики .

Нередко о механизме твердофазных реакций судят лишь на основании того, что экспериментальные данные о степени взаимодействия как функции времени описываются лучше всего какой - либо конкретной кинетической моделью и соответствующим уравнением кинетики. Такой подход может привести к неверным выводам.

Процессы в твердофазных материалах имеют ряд важных отличий от процессов в жидкостях или газах. Эти отличия связаны, прежде всего, с существенно (на несколько порядков) более низкой скоростью диффузии в твердых телах, что препятствует усреднению концентрации компонентов в системе и, таким образом, приводит к пространственной локализации протекающих процессов. Пространственная локализация в свою очередь приводит к тому, что в наблюдаемую кинетику процессов вносит вклад как удельная скорость процесса (или коэффициент диффузии), так и геометрия реакционной зоны. Такие определяемые геометрическими факторами особенности твердофазных процессов называют топохимическими. Кроме того, поскольку обсуждаемые превращения пространственно локализованы, их скорость может определяться как собственно процессами на границе раздела фаз (реакционный контроль), так и скоростью подвода к этой границе какого-либо из компонентов или отвода продукта(ов) (диффузионный контроль). Эти случаи для простых систем, для которых выполняются модельные предположения, могут быть идентифицированы в эксперименте по виду временной зависимости степени превращения. Еще одна особенность фазовых превращений в твердых телах связана с тем, что образование зародыша новой фазы в твердой матрице вызывает появление в последней упругих напряжений, энергия которых в ряде случаев должна учитываться при рассмотрении термодинамики этих превращений.

Большое число факторов, влияющих на кинетику твердофазных процессов и микроструктуру получаемых при этом материалов, определяет и множественность типов классификации этих процессов. Так, рассматривая устойчивость системы по отношению к флуктуациям различного типа, выделяют гетерогенные (в случае систем, устойчивых к малым по занимаемому объему флуктуациям и неустойчивых к большим) и гомогенные (в случае систем, неустойчивых к малым флуктуациям) процессы. Для гетерогенных процессов в качестве примера можно привести превращения, идущие по механизму образования и роста зародышей, для гомогенных -- некоторые переходы порядок--беспорядок и спинодальный распад твердых растворов.

От гетерогенных и гомогенных процессов необходимо отличать гетерогенное и гомогенное зародышеобразование в случае гетерогенных процессов. Гетерогенным зародышеобразованием называют образование зародышей на дефектах структуры (включая точечные дефекты дислокации и границы раздела фаз); гомогенным зародышеобразованием -- образование зародышей в бездефектном объеме твердой фазы.

Анализируя продукт твердофазного превращения, различают однофазные и многофазные зародыши. В случае многофазных зародышей продуктом процесса оказывается многофазная колония с характерной микроструктурой, определяемой поверхностной энергией границы образующихся фаз; процессы данного типа называют прерывистыми в отличие от непрерывных в случае образования и роста однофазных зародышей.

Еще один способ классификации твердофазных превращений основан на сопоставлении состава исходной фазы и состава продукта реакции. В случае их совпадения говорят о бездиффузионных процессах, а при изменении состава -- о диффузионных. Причем из бездиффузионных полезно выделить кооперативные процессы (например, мартенситное превращение), происходящие путем одновременного незначительного перемещения атомов в большом объеме исходной фазы.

Бездиффузионные фазовые превращения могут различаться по типу изменяющихся в ходе процесса их термодинамических характеристик.

Превращениями первого рода называют процессы, при которых происходит изменение производных химического потенциала по температуре или давлению. Отсюда следует скачкообразное изменение при фазовом переходе таких термодинамических параметров, как энтропия, объем, энтальпия, внутренняя энергия. При превращениях второго рода первые производные химического потенциала по интенсивным параметрам не меняются, но изменяются производные более высоких порядков (начиная со второго). В этих процессах при непрерывных энтропии и объеме системы происходит скачкообразное изменение величин, выражаемых через вторые производные энергии Гиббса: теплоемкости, коэффициента теплового расширения, сжимаемости и т.д.

Твердофазные реакции между двумя фазами (контакты между тремя или более фазами маловероятны, а соответствующие процессы могут быть представлены как комбинации нескольких двухфазных реакций) относятся к диффузионным процессам и могут быть как гетерогенными, так и гомогенными, как с гетерогенным, так и с гомогенным зародышеобразованием. Гомогенные процессы и процессы с гомогенным зародышеобразованием при таких реакциях возможны, например, в случае образования метастабильного твердого раствора с последующим его распадом (так называемые внутренние реакции). Примером таких процессов может быть внутреннее окисление.

Условием термодинамического равновесия при твердофазном превращении, как и при любом другом химическом превращении, является равенство химических потенциалов компонентов в исходных веществах и продуктах реакции. При взаимодействии двух твердых фаз указанное равенство химических потенциалов может реализовываться разными способами: 1) перераспределение компонентов в исходных фазах с образованием твердых растворов; 2) образование новых фаз с другой кристаллической структурой (что, собственно, обычно и называют твердофазной реакцией), причем поскольку химический потенциал компонента в различных фазах многофазной системы не зависит от количества каждой фазы, равновесие может быть достигнуто только при полном превращении исходных фаз . Наиболее достоверные сведения о механизме твердофазных реакций получают при комплексном использовании, позволяющим одновременно наблюдать несколько параметров реагирующей системы, включая фазовый состав, тепловые эффекты, изменение массы и другое.

Термодинамическая теория твердофазных реакций была предложена Вагнером, а в дальнейшем развита Шмальцридом на примере реакций присоединения.

К настоящему времени нет единой классификации большого разнообразия гетерогенных реакций. Связано это с трудностью выбора критерия в качестве основы такой универсальной классификации. По химическим критериям реакции подразделяются на реакции окисления, восстановления, разложения, соединения, обмена и т. д. Наряду с указанным критерием широко используется в качестве основного критерий физического состояния реагентов :

Характерной чертой всех гетерогенных реакций является существование и локализация на границе раздела фаз реакционной зоны. Реакционная зона, как правило, малой толщины разделяет две области пространства, занятые веществами различного состава и с различными свойствами. Причины образования реакционной зоны обычно делятся на две группы: относительная медленность процессов диффузии и химические причины. Последняя группа обусловлена большой реакционной способностью находящихся на поверхности твердого реагента или на поверхности раздела двух имеющихся фаз атомов или молекул. Известно, что поверхность твердого или жидкого вещества обладает свойствами, отличными от объемных свойств компактного образца. Это делает свойства поверхности раздела фаз специфичными. Именно здесь происходит существенная перестройка кристаллической упаковки, снижаются напряжения между двумя кристаллическими решетками, происходит изменение химического состава.

Так как массоперенос осуществляется путем диффузии, а диффузионная подвижность частиц твердого тела зависит от дефектности его структуры, можно ожидать существенного влияния дефектов на механизм и кинетику твердофазных реакций. Эта стадия предшествует химической стадии превращения реагирующих веществ на межфазной поверхности раздела. Таким образом, кинетика гетерогенных реакций определяется как характером протекания самой химической реакции, так и способом доставки вещества в реакционную зону. В соответствии с отмеченным скорость реакций будет лимитироваться химической стадией (химическая кинетика) или диффузией (диффузионная кинетика). Такое явление и наблюдается в действительности.

По Вагнеру диффузия и, следовательно, реакция в твердых телах осуществляется главным образом за счет подвижности ионов и электронов, обусловленной неравновесным состоянием решетки. Различные ионы решетки перемещаются в ней с разной скоростью. В частности, подвижность анионов в подавляющем большинстве случаев ничтожно мала по сравнению с подвижностью катионов. Поэтому диффузия и соответственно реакция в твердых телах осуществляется за счет перемещения катионов. При этом диффузия разноименных катионов может идти в одном направлении или навстречу друг другу. При разнозарядных катионах электронейтральность системы сохраняется за счет движения электронов. За счет различия в скоростях перемещения разнозарядных катионов в системе возникает электрический потенциал. В результате скорость перемещения более подвижных ионов уменьшается и, наоборот, для менее подвижных? увеличивается. Таким образом, возникающий электрический потенциал регулирует скорости диффузии ионов. Последняя и определяемая ею скорость всего процесса твердофазного превращения может быть рассчитана на основе электронной проводимости и чисел переноса. Очевидно, что направленная диффузия ионов возможна лишь в электрическом поле или при наличии градиента концентрации в системе.

При синтезе веществ в твердом состоянии часто оказывается необходимым контролировать не только химический (элементный и фазовый) состав получаемого продукта, но и его микроструктурную организацию. Это связано с сильной зависимостью как химических (например, активности в твердофазных реакциях), так и многих физических (магнитных, электрических, оптических и т.д.) свойств от характеристик структурной организации твердого тела на различных иерархических уровнях. К первому из таких уровней можно отнести элементный состав твердого тела и способ взаимного расположения атомов элементов в пространстве - кристаллическую структуру (или особенности ближайшего координационного окружения атомов в аморфных твердых телах), а также состав и концентрацию точечных дефектов. В качестве следующего уровня структуры твердого тела может быть рассмотрено распределение в кристалле протяженных дефектов, определяющее размеры областей, в которых (с поправкой на существование точечных дефектов) наблюдается трансляционная симметрия в расположении атомов. Такие области могут считаться совершенными микрокристаллами и называются областями когерентного рассеяния. Говоря об областях когерентного рассеяния, необходимо помнить, что в общем случае они не эквивалентны образующим твердофазный материал компактным частицам, которые могут содержать значительное количество протяженных дефектов, а следовательно, и областей когерентного рассеяния. Совпадение областей когерентного рассеяния с частицами (которые в этом случае называют однодоменными) обычно наблюдается лишь для достаточно малых (менее 100 нм) размеров последних. Последующие структурные уровни могут быть связаны с формой и распределением по размерам образующих порошкообразный или керамический материал частиц, их агрегацией, агрегацией первичных агрегатов и т.д.

Различные области применения твердофазных материалов предъявляют разные, часто противоположные требования к перечисленным выше структурным характеристикам и, следовательно, требуют применения разных синтетических методов . Поэтому правильнее говорить о методах синтеза не твердофазных веществ, а твердофазных материалов и в каждом случае выбирать метод синтеза с учетом области последующего применения получаемого продукта.

В общем случае методы синтеза твердофазных материалов могут быть классифицированы по удалению от термодинамически равновесных условий протекания используемых химических процессов. В соответствии с общими закономерностями, при условиях, отвечающих состоянию, максимально удаленному от равновесного, наблюдается значительное превышение скорости зародышеобразования над скоростью роста образовавшихся зародышей, что, очевидно, приводит к получению максимально дисперсного продукта. В случае же проведения процесса вблизи термодинамического равновесия рост уже образовавшихся зародышей происходит быстрее образования новых, что в свою очередь позволяет получать крупнокристаллические (в предельном случае -- монокристаллические) материалы. Скоростью роста кристаллов в значительной степени определяется и концентрация в них протяженных (неравновесных) дефектов.

Использование: в химии пептидов при синтезе пептидных цепей, содержащих гистидин и серин. Сущность изобретения: способ твердофазного синтеза пептидов общей ф-лы 1, включающий присоединение N-защищенных концевых аминокислот к инертному твердому носителю, последующее добавление N-защищенных аминокислот к наращиваемой пептидной цепи, причем боковую цепь остатка серина временно защищают группой, лабильной по отношению к агентам, используемым для удаления альфа-аминозащитных групп, а боковую цепь гистидина, если она присутствует, защищают группой, лабильной по отношению к альфа-аминодеблокирующему агенту; удалением в конце каждого цикла защитной группы, отщеплением полипептида от носителя с использованием аминолиза или аммонолиза, выделением образующегося соединения I. Ф-ла I: R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 -heu-R 5 -Pro-R 6 , где R 1 -пиро -Glu, N-AcDNal; R 2 His, DpClPhe, DpFPho, R 3 = Тгр, Д-Тгр; R 4 = DNal(2), Dh Arg(Et) 2 Dh Агд(Bu), Dh Arg(CH 2 CF 3) 2 R 5 = Агд, L-Arg(Et) 2 L-hАгд(Bu), L-hArg(CH 2 CF 3) 2 R 6 GlyNH 2 DAla NH 2

Изобретение относится к твердофазному синтезу аналога гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (ЛН-рилизинг гормона), путем метода минимальной защиты. Аналоги ЛГ-рилизинг гормона (далее упоминается как ЛГ-РГ) представляют собой нона- или декапептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ и проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-PГ. Аналоги являются предметом широкого клинического исследования вследствие их продемонстрированной способности облегчать симптомы эндометриоза, рака предстательной железы, преждевременного полового созревания и других гормонально-опосредованных заболеваний. Несмотря на то, что определенные аналоги ЛГ-РГ в настоящее время пригодны для терапевтического использования, их синтез является сложным процессом, а следовательно, и дорогостоящая методика их получения повышает стоимость аналогов, так необходимых при лечении. Аналоги ЛГ-РГ традиционно описываются либо как агонисты, либо как антагонисты, в зависимости от образа их действия. Аналоги ЛГ-РГ в соответствии с изобретением представляют собой нона- и декапептиды и включают как агонистов, так антагонистов. Примерами агонистов ЛГ-РГ, являющихся пригодными в настоящем изобретении, могут стать нафарелин, лейпрорелин, бусерелин, госерелин, гистерелин, трипторелин, и деслорелин, причем они отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения замещением остатка глицина в положении 6 D-аминокислотой. Синтетические агонисты имеют заодно с гормоном природного происхождения, гистидин в положении 2, серин в положении 4, и тирозин в положении 5, причем все эти остатки имеют реакционоспособные боковые цепи, которые могут стать синтетическими трудностями. Антагонисты ЛГ-РГ отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения, как правило, делецией или замещением остатка гистицидина в положении 2. С точки зрения синтетической перспективы делеция гистидина снижает вероятность возникновения нежелательных побочных реакций, однако, присутствие серина и тирозина все же требует принятия специальных мер с целью устранения возникновения побочных цепных реакций. Аналоги ЛГ-РГ могут быть синтезированы различными методами, такими, как например, описанные ДжМ.Стюартом и Дж.Д.Янгом, Твердофазный Пептидный Синтез, Уи. Х. Фриман Ко. Сан-Франциско, 1969; Дж.Мейненхофером, Гормональные Белки и Пептиды, Том 2, стр.46, Академик Пресс (Нью-Йорк), 1973; и Е.Шредером и К.Любке, Пептиды, Том l", Академик Пресс (Нью-Йорк), 1965. Методы могут быть в широком смысле охарактеризованы либо как растворно-фазные, либо как твердо-фазные методики. Оба метода включают последовательное прибавление аминокислот в растущую пептидную цепь. Обычно, или амино-, или карбоксильную группу первой аминокислоты защищают посредством пригодной защитной группы. Защищенную аминокислоту затем можно либо присоединить к инертному твердому носителю либо использовать в растворе путем прибавления следующей защищенной аминокислоты в последовательности при условиях, пригодных для образования амидной связи. Защитную группу затем отщепляют от этого вновь прибавленного аминокислотного остатка, после чего осуществляют прибавление следующей аминокислтоы, и так далее. После того, как все требуемые аминокислоты присоединены в должной последовательности, любые оставшиеся защитные группы и любой твердый носитель удаляются с получением конечного полипептида. Путем простой модификации данной общей методики можно прибавить более одной аминокислоты за одно время в растущую цепь, например, путем сочленения защищенного трипептида с защищенным дипептидом, что позволяет получить пентапептид. Более строгие условия твердофазного синтеза обычно требуют, чтобы любые реакционноспособные боковые цепи на аминокислотах были защищены во время образования амидной связи. Защитные группы боковой цепи обычно отщепляют в отдельной стадии после отщепления образованного полипептида от инертного носителя, или совместно с этим отщеплением. Один особенно пригодный метод твердофазного синтеза с целью получения аналогов ЛГ-РГ описан в патенте США N 4234571 (Нестор и др.), раскрытие которого введено в данное описание в качестве отсылки. При таком общем подходе функцию -амино (N ) каждой аминокислоты защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию, такой, как трет-бутилоксикарбонил (Вос); любые реакционноспособные боковые цепи, как например, присутствующие на серине, гистидине и тирозине, также защищают сильно связанными группами, которые требуют обработки фторoводородом (HF) или подобных радикальных методик, для их отщепления. Кроме того, отщепление -аминозащитных групп и защитных групп в боковой цепи обычно осуществляют в отдельной стадии. Данный подход является достаточным для получения исследовательских количеств пептидов, однако при крупномасштабном производстве пептидов эти методы являются недостаточными. Аминокислоты с полностью защищенными боковыми цепями являются дорогостоящими, а такие расходы могут стать существенным фактором при коммерческом производстве пептидов. Кроме того, использование фтороводорода, не говоря уже об отравлении окружающей среды, приводит к коммерчески неприемлемым потерям в выходе продукта. И что более важно, вследствие использования отдельной производственной стадии для отщепления защитных групп боковой цепи синтетический процесс требует дополнительного времени и стоимости. Альтернативные способы не более привлекательны. Тиен и др. Pept. Chem. 375-379, Т, Шиба и С.Сакакибара (Ред.), Организация по Исследованию Белков, Осака (1088), изложили синтез ЛГ-РГ с использованием тозил-защиты относительно гистидина и бензил-защиты относительно тирозина и серина. Данный подход устраняющий необходимость использования фтороводорода, все же предполагает наличие отдельной стадии дегидрирования с целью отщепления бензил-защитных групп; при этом происходит некоторое восстановление триптофана. Кой Д.Х. и др. Int. I. Peptide Protein Res. 14, 339-343 (1979), приводят синтез антагонистов ЛГ-РГ, (D-Phe 2 , D-Trp 3 , D-Jhe 6) ЛГ-РГ, с использованием целого ряда методов защиты боковой цепи, при этом все они предполагают освобождение HF от защиты; в результате чего обеспечивается бензил-защита боковой цепи только серина, тозил-защита боковой цепи только аргинина, защита боковой цепи серина и аргинина, а также защита боковой цепи серина, аргинина и тирозина (с 2-бромбензил-оксикарбонилом). Солевая защита аргинина (в виде Arg HCl) также используется в синтезе "только серина". Фтороводород используют для отщепления неочищенного пептида от его носителя, а также для отщепления защитных групп боковой цепи. Только когда пептид "полностью" незащищен (и только солевая защита относительно аргинина), тогда только авторы патента могут избежать фторидной обработки. Все виды синтеза с защитой приводят к плохим результатам по сравнению с синтезом с незащищенной боковой цепью. Кой и др. далее приводят синтез агониста ЛГ-РГ: этиламида (D-Leu 6 , дес Gly-NH 2 10)-ЛГ-РГ, с использованием защиты боковой цепи динитрофенилом относительно только гистидина, солевой защиты аргинина, но без обработки HF. Динитрофенильную защитную группу боковой цепи отщепляют во время отщепления пептида от его носителя с помощью раствора этиламина в диметилформамиде. Выход в результате синтеза с защитой только гистидина составляет лишь 34% по сравнению с выходом в результате синтеза с полной защитой и обработкой HF. Отсутствует сравнение с незащищенным синтезом. Известные технические решения предполагают, что среди различных стратегий минимальной защиты защита только гистидина может привести к повышению выхода по сравнению с синтезом на основе полной защиты в отношении некоторых антагонистов ЛГ-РГ, однако никакой определенной выгоды нельзя извлечь в результате рассмотрения приведенных подходов к защите боковой цепи в отношении агонистов ЛГ-РГ. Тем временем, как идеальный подход к устранению стадии освобождения от защиты HF можно осуществлять в отношении незащищенного синтеза, отсутствие защиты для гистидина приводит к избыточной рацемизации. В соответствии с доктриной Коя и др. заявитель, однако, обнаружил, что использование защиты только гистидина также приводит к получению высоких уровней примеси бис-серина, вследствие ацилирования остатка серина. С целью достижения синтеза с минимальной защитой в отношении аналогов ЛГ-РГ без проведения стадии освобождения от защиты необходимо значительное усовершенствование по сравнению с известными техническими решениями, которое может также обеспечить защиту для тех групп, которые, когда незащищены, оказывают отрицательное влияние на чистоту и выход пептида. Целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, в котором защищены боковые цепи только минимального числа аминокислотных остатков. Другой целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, который устраняет необходимость освобождения от защиты HF, а также необходимость использования токсичного HF-реагента, уменьшая токсичный отработанный поток, часто встречающийся в традиционных способах. Упомянутые аспекты изобретения создают дополнительные преимущества, заключающиеся в снижении стоимости получения соединений лГ-РГ, а также в устранении дополнительной стадии отщепления защитных групп боковой цепи. Цели изобретения достигаются в отношении аналогов ЛГ-РГ с использованием способа временной минимальной защиты, при которой только гидроксильная боковая цепь аминокислотного остатка защищена группой, которую отщепляют сразу же после связывания серина с пептидной цепью. Защитная группа боковой цепи является группой, лабильной при тех же условиях, которые пригодны для отщепления -амино защитных групп. Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые содержат остаток гистидина, боковую цепь имидазола также можно защитить группой, лабильной в течение цикла связывания, преимущественно, лабильной для агента разблокировки -аминогруппы, однако, по выбору, она может быть защищена группой, отщепляемой аминозилом или аммонолизом. Временная защита боковой цепи серина и защита боковой цепи гистидина, если только имеется в наличии, минимизирует образование примесей и максимизирует выход продукта без необходимости в стадии освобождения от защиты HF. Способ временной минимальной защиты в соответствии с изобретением приемлем для твердофазного синтеза любого сериносодержащего полипептида, имеющего от нескольких до множества остатков, не взирая на остальную часть последовательности. Аналоги ЛГ-РГ, а также другие нона- и декапептиды являются предпочтительными синтетическими мишенями. Несмотря на то, что изобретение описано с учетом последовательного прибавления отдельных аминокислот, специалист в данной области техники поймет, что способ в равной мере приемлем для синтеза, в котором блоки меньших полипептидов связывают с образованием более крупных полипептидов, например, путем прибавления тетрапептида к пентапептиду, при условии, что боковая цепь остатков серина временно защищена в течение цикла связывания серина. Временная защита означает, что боковая цепь серина защищена в течение относительно короткого периода синтетического цикла. Защитная группа боковой цепи и -амино и карбоксильная защитная группа отщепляются одновременно после осуществления связывания серина. Как правило, решающим критерием отбора защитной группы боковой цепи серина является тот факт, чтобы группа была устойчивой к условиям связывания, однако лабильной к условиям освобождения от защиты -аминогруппы. В одном варианте настоящего изобретения с использованием -аминозащиты боковую цепь серина предпочтительно защищают группой, выбранной из трет-бутила, трет-бутилдиметилсилила, триметилсилила, тритила, пивалила и тетрагидропиран-2-ила. Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые имеют остатки гистидина, как правило, желательно защищать боковую цепь имидазола. Эта защита также может иметь разновидность временной, то есть лабильной во время цикла связывания, или может оставаться на месте до тех пор, пока пептид не будет отщеплен от своего носителя. Предпочтительно, аминолиз или аммонолиз используют для отщепления полимера от своего носителя, и одновременно отщепляют защитную группу для гистидина. В другом варианте изобретения агент разблокировки выбирают из растворов хлористого водорода в С 3 -С 6 -спиртах и дихлорметане. Предпочтительно, отношение спирта к дихлорметану составляет от 0,1 до 10,0 (об.), а концентрация кислоты составляет от 2 до 9 н. Наиболее предпочтительно, спиртом является изопропанол. Сокращения и Определения Для изобретения выражение "ЛГ-РГ" относится к гормону, высвобождаемому лютеинизирующий гормон, и "аналоги Лг-РГ" подразумевают сам ЛГ-РГ, а также другие полипептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ или происходят от него, и которые проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-РГ. Сокращения для различных традиционных аминокислот рекомендованы Комиссией по Биохимической Номенклатуре Международного союза теоретической и прикладной химии Международного биохимического союза (ИЮПАК-МБС), Биохимия, 11, 1726 (1972). Все упоминаемые здесь пептидные последовательности написаны в соответствии с общепринятой конвенцией, где N концевая аминокислота находится слева и С-концевая аминокислота находится справа. Сокращения, приводимые здесь, представляют L-аминокислоты, за исключением ахирального аминокислотного глицина, и за другим исключением любой ненатуральной аминокислоты, которая является ахиральной, или же аминокислоты обозначены как D- или D, L-. Et обозначает этил. Bu обозначает бутил и iPr обозначают изопропил. Другие сокращения, пригодные при описании изобретения, включают замещения аминокислот в натуральном пептиде ЛГ-РГ следующими аминокислотными остатками: Аминокислотный Сокращение остаток 3-(2-нафтил)аланил Nal (2) 3-(п-фторфенил)аланил р-F-Phe 3-(п-хлорфенил)аланил р-Cl-Phe 3-(3-пиридил)аланил Pal (3) N G ,N G" -бис(этил)гомо- аргинил hArg (Et) 2 N G ,N G" -бис(2,2,2- трифторэтил)гомо- аргинил hArg (CH 2 CF 3) 2 N G -бутил-гомоаргинил hArg (Bu) N E -Изопропил-лизил Lys (iPr) (бензил)гистидил His (Bzl) Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют требуемую биологическую активность родственного соединения без побочных токсикологических эффектов. Примерами таких солей являются кислые аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами, например, хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и так далее; и соли, образованные органическими кислотами, такими, как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфокислота, нафталиндисульфокислота, полигалактуроновая кислота и так далее. Сокращение "N-Ac" относится конкретно к N-ацетил-защитной группе, то есть, ацетильной группе, присоединенной к концевому аминокислотному осстатку на аминном азоте, в соответствии с общепринятой номенклатурой. Предпочтительные варианты В одном варианте осуществления изобретения предлагается усовершенствованный способ минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения, имеющего аминокислотную последовательность формулы: R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 -Leu-R 5 -Rro-R 6 (1) где R 1 выбирают из (пиро) Glu и N-Ac-D-Nal (2); R 2 выбирают из His. D-p-Cl-Phe и D-p-F-Phe; R 3 выбирают из Trp. D-Trp. R 4 выбирают из D-Nal- (2), D-hArg (Et) 2 . D-hArg (Bu), D-hArg (CH 2 CF 3) 2 . R 5 выбирают из Arg, L-hArg (Et) 2 , D-hArg (Bu), D-hArg- (CH 2 CF 3) 2 . R 6 выбирают из Cly-NH 2 , D-Ala-NH 2 , причем аминокислоты обеспечены N -защитой, отличающийся тем, что осуществляют (а) временную защиту боковой цепи серина в положении 4, пригодно, с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления -аминозащитных групп, без проведения рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от его полимерного носителя, и (b) защиту боковой цепи гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к агенту разблокировки -аминогруппы или к аминолизу или аммонолизу. В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ временной минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения формулы (l), в котором (а) защищают -аминогруппы аминокислот в полипептиде, (b) защищают боковую цепь серина с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления -аминозащитной группой, (с) защищают боковую цепь гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к основным агентам разблокировки или группе отщепляемой аминолизом или аммонолизом, (d) привязывают С-концевую аминокислоту к инертному твердому носителю, (е) последовательно связывают, с помощью пригодного связующего средства, одну или более отобранных аминокислот одна с другой в последовательных циклах, начиная с С-конца, (f) отщепляют, к концу каждого цикла, защитные группы путем обработки агентом разблокировки, причем указанный агент разблокировки выбирают из агентов, способных отщеплять как -аминозащитную группу, так и защитную группу боковой цепи, без рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от полимера, (g) повторяют стадии связывания и отщепления с образованием нона- и декапептида, (h) отщепляют полипептид от носителя аминолизом или аммонолизом и (i) выделяют и очищают полученный полипептид. В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ твердофазного синтеза соединения формулы l, в котором (а) связывают твердофазным синтезом соответствующий Вос-защищенный и трет-бутил-защищенный серин в последовательных циклах и в порядке справа налево относительно аминокислотной последовательности соединения формулы l, начиная с Вос-R6-O-, ковалентно связанного с инертным твердым носителем, (b) отщепляют, в начале каждого цикла, Вос-защитную группу и одновременно трет-бутиловую группу от серина или D-серина путем обработки агентом разблокировки, выбранным из HCl/CH 2 Cl 2 HCl (низший алканоил) СH 2 Cl 2 , с образованием полипептидной связи с ука- занным твердым носителем, (с) отщепляют полипептид от носителя аммонолизом и (d) выделяют полученный полипептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагается способ, описанный выше, для получения полипептида, имеющего приведенную выше формулу, где R 1 обозначает (пиро) Glu или N-Ac-D-Nal (2); R 2 обозначает His или D-p-Cl-Phe; R 3 обозначает Trp; R 4 обозначает D-Nal (2), D-hArg (Et) 2 ; R 5 обозначает Arg или L-hArg (Et) 2 и R 6 обозначает Gly-NH 2 , или D-Ala-NH 2 . В предпочтительном варианте осуществления изобретения функцию -амино (N ) аминокислот защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию. Защитная группа устойчива к условиям образования пептидной связи, хотя легко отщепляется без разрушения растущей пептидной цепи или рацемизизации любого из хиральных центров, содержащихся в ней. Пригодными защитными группами являются трет-бутоксикарбонил (Вос), бифенилизопропилоксикарбонил, трет-амилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, -диметил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, о-нитрофенилсульфенил, 2-циано-трет-бутилоксикарбонил, 9-фторэнилметилоксикарбонил (Fmoc) и так далее. Предпочтительно -аминозащитной группой является трет-бутоксикарбонил (Вос). Когда желательно получить пептид такой, как бусерелин или госерелин, в котором R 4 в Формуле (1) выше обозначает D-Ser (трет-Bu), Fmoc является предпочтительным для N -защиты в циклах связывания, включающих и следующих за прибавлением D-Ser (tBu). Fmoc является лабильным и к основным реагентам (рН 8,5), таким как пиперидин, который не отщепляет tBu от D-Ser (tBu). В последних циклах после прибавления D-Ser (tBu) необходимо использовать чувствительную к основанию N -защиту. Боковую цепь серина в положении 4 защищают группой, которая может быть отщеплена, например, мягкой фторидной обработкой. Предпочтительной защитной группой боковой цепи серина является трет-бутилдиметилсилил. Гидроксильную боковую цепь остатка серина защищают во время связывания серина с растущим пептидом, как описано для общего варианта настоящего изобретения. Защитную группу боковой цепи отщепляют после связывания и перед прибавлением следующей аминокислоты. Защитную группу боковой цепи серина отщепляют тем же реагентом, который используют для отщепления N -защитной группы. Предпочтительными защитными группами боковой цепи серина являются трет-бутил, трет-бутилдиметилсилил, триметилсилил, тритил, пивалил и тетрагидропиран-2-ил. Кроме того, также защищают имидазоловую боковую цепь гистидина, обычно присутствующего в агониcтах ЛГ-РГ. Защитная группа боковой цепи гистидина может быть также лабильной во время цикла связывания, например, лабильной к агенту разблокировки N -группы, однако, необязательно, ее отщепление может быть осуществлено, когда пептид отщеплен от его носителя. Предпочтительными защитными группами боковой цепи для гистидина являются п-толуолсульфонил и 2,4-динитрофенил. Для инициации синтеза первую аминокислоту, которой, как правило, является С-концевая аминокислота в конечном продукте, присоединяют к пригодному твердому носителю. Пригодными твердыми носителями в вышеуказанном синтезе являются те материалы, которые инертны к реагентам и реакционным условиям ступенчатых реакций конденсации-разблокировки, а также нерастворимы в используемых средах. Примерами коммерчески приемлемых полимеров являются стирол/дивинилбензоловые полимеры, модифицированные реакционноспособной группой, например хлорметилированный стирол-дивинилбензоловый сополимер, гидроксиметилированный стирол/дивинилбензоловый сополимер и так далее. Пpедпочтительным является полимер Merrifield (1% сшитый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола). Присоединение к полимеру, например, хлорметилированному стирол-дивинилбензоловому полимеру, осуществляют при помощи взаимодействия N -защищеннoй С-концевой аминокислоты, особенно, N -Вос аминокислоты, в виде ее цезиевой, тетраметиламмониевой, триэтиламмониевой, 1,5-диазабицикло(5.4.0)ундец-5-еновой или аналогичной соли в этаноле, ацетонитриле, N,N-диметилформамиде (ДМФ) и так далее, особенно, цезиевой соли в ДМФ, с хлорметилированным полимером при повышенной температуре, например, около 40-60 о С, предпочтительно, около 50 о С, в течение периода времени около 12-72 часов, предпочтительно, около 48 часов. Связывание последующих защищенных аминокислот осуществляют хорошо известными методами, обычно в автоматизированном пептидном синтезаторе. Каждую защищенную аминокислоту интродуцируют приблизительно при 1,5-2,5-кратном молярном избытке, и связывание осуществляют в инертном, неводном, полярном растворителе, таком как дихлорметан, ДМФ или их смеси, предпочтительно, в дихлорметане, при температуре почти комнатной. Связующий агент выбирают из N, N"-дициклогексилкарбодимида (ДЦК), N,N"-ди-изо-пропилкарбодиимида (ДИК) или другого карбодиимида, либо в отдельности, либо в присутствии 1-гидроксибензотриазола (HBt), О-ацилмочевин, бензотриазол--ил-окси-трис(пирролидино фосфоний) гексафторфосфата (РуВор), N-гидроксисукцинимида, других N-гидроксиимидов или оксимов. Альтернативно, могут быть использованы активные сложные эфиры защищенных аминокислот (например, п-нитрофенил, пентафторфенил и тому подобное) или симметрические ангидриды. Пептидный полимер проверяют на полное связывание с использованием Теста Кайзера (Anal. Biochem. 34, 595 (1970) за исключением того, что в случае связывания с пролином используют Тест Хлоранила (Anal. Biochem. 117, 145 (1981)) или Тест Изатина (Anal. Chim. 118, 149 (1980)). Если тест (ы) на полноту показывают, что реакция не завершена, связывание повторяют с использованием дополнительной аминокислоты, однако, опуская разблокировку дополнительной кислоты. Когда последнее связывание завершено, полимер промывают метанолом или метанолом, содержащим дихлорметан, и сушат при максимальной температуре 60 о С. В конце каждого цикла, то есть, после каждого прибавления следующей N -защищенной аминокислоты в растущую полипептидную цепь, защитную группу отщепляют путем обработки агентом разблокировки. При добавлении серина агент разблокировки удаляет как N -Вос-защитную группу, так и серин-защитную группу. Среди предпочтительных агентов разблокировки следует упомянуть хлорoводород в дихлорметане (HCl/-CH 2 Cl 2), трифторуксусную кислоту в дихлорметане (ТФК/СH 2 Cl 2) и хлороводород, растворенный в С 3 -С 6 -спирте, предпочтительно, изопропаноле, смешанном с дихлорметаном. как правило, концентрация HCl составляет от 2 н. до 9 н. предпочтительно от 4 н. до 5 н. Отношение CH 2 Cl 2 к С 3 -С 6 -спирту составляет 0,1-10 (объемн.); предпочтительно, около 1:1. Особенно предпочтительным агентом разблокировки является 4,5 н. раствор HCl в i-PrOH: CH 2 Cl 2 (1:1). Стадия разблокировки обычно имеет место при температурах от 0 до 45 о С, предпочтительно при температурах окружающей среды (от 20 до 27 о С). Специалист в данной области техники поймет, что отбор протокола связывания/разблокировки с использованием агентов иных, нежели, описаны выше, является правильным при условии, что остаток серина освобожден от защиты с помощью агента, который отвечает целям изобретения. Можно использовать методику с применением HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2 для каждого цикла освобождения от защиты. Альтернативно, также приемлем смешанный метод, в котором ТФК/CH 2 Cl 2 используют для определенных циклов, а HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2 для других. Специалисту станут понятны и другие циклы. В конце твердофазного синтеза полипептид отщепляют от полимерного носителя. Отщепление проводят с помощью аммонолиза насыщенным раствором аммиака в пригодном растворителе для пептидов с С-концом аланина или глицина; для пептидов, имеющих С-конец пролина, отщепление осуществляют при помощи аминолиза алкиламином или фторалкиламино. Отщепление проводят при температуре приблизительно от 10 до 50 о С, предпочтительно, около 25 о С, в течение периода времени около 12-24 ч, предпочтительно, около 18 ч. Пригодные растворители включают метанол, этанол, изопропанол, диметилформамид, тетрагидрофуран, N,N-диметилэтаноламин, гексаны и их смеси. Предпочтительно, используют насыщенный раствор аммиака в метаноле. Альтернативно, пептид может быть отщеплен от полимера путем трансэстерификации основанием с последующим аминолизом. Затем полипептид очищают с использованием последовательности хроматографических стадий, применяя любой или все следующие типы: ионообменная хроматография на слегка основной смоле в ацетатной форме; гидрофобная абсорбционная хроматография или недериватизированная полистирол-дивинил-бензоловая (например, Amberlite XAD) хроматография; абсорбционная хроматография на силикагеле; ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе; распределительная хроматография (например, на Sephadex G-25) или противоточное распределение; жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР), особенно, обращеннофазная ЖХВР на колонке с октил- или октадецилсилил-кремнеземом. Если рацемическую аминокислоту используют в одном или более положениях 1, 2, 3 или 6, и отдельные изомерные продукты представляют интерес, диастереомерные нонапептидные или декапептидные конечные продукты подвергают разделению после чего искомый полипептид, содержащий D-аминокислоту в соответствующем положении, выделяют и очищают, предпочтительно, во время осуществления вышеописанной хроматографической методики. Выделенный и очищенный полипептид, необязательно, превращают в фармацевтически приемлемую соль. Следующие примеры сравнивают способ временной защиты настоящего изобретения с незащищенным способом как для агониста ЛГ-КРГ, так и для антагониста ЛГ-РГ. Эти примеры представлены для целей только лишь специфичности и не должны ограничивать объем заявленного изобретения. В обоих продуктах примеров 1 и 3, использующих способ минимальной защиты изобретения, находится значительно меньшее количество примесей по сравнению с продуктами, полученными в примерах 2 и 4, использующих незащищенный синтез. Кроме меньшего числа примесей, способ настоящего изобретения отличается дополнительными преимуществами в смысле более высоких выходов продукта и использования менее опасных реагентов, в течение более короткого периода времени и с меньшими расходами энергии при выделении и очистке аналогов ЛГ-РГ. Дополнительным преимуществом является производство меньших количеств значительно менее токсичного отработанного потока. Получение А. Получение Вос-Gly-O-Полимера. 4,9 г N -Вос-глицина растворяют в смеси 50 мл метанола и 50 мл дистиллированной воды. рН раствора доводят до 7,5 водным бикарбонатом цезия. Затем растворитель удаляют в вакууме. Через 18 ч сушки под высоким вакуумом остаток растворяют в 150 мл сухого ДМФ. Прибавляют 25 г в 1% хлорметилированного полистирол/дивинилбензолового (Merrifield) полимера (соответствует 25 ммоль хлорида). Смесь встряхивают при 50 о С течение 24 ч, фильтруют и полимер промывают последовательно ДМФ, водой и этанолом. Полимер сушат в вакууме в течение 3 дней с получением 28,34 г Boc-Gly-О-Полимера. Получение В. Получение Вос-Ala-О-Полимера. В соответствии с методикой Получения A N -Boc-D-аланин прибавляют к 1% полимеру Merrifield с получением N -Boc-D-Ala-O-Полимера. П р и м е р 1. Синтез нафарелина с использованием минимальной защиты серина. В данном примере нафарелин получают с использованием следующего метода защиты боковой цепи: солевая защита относительно аргинина (в виде хлорида), тозиловая защита относительно гистидина и трет-бутиловая защита относительно серина. N -Вос-аминокиcлоты получают из Бачем (Торанс, Калифорния) (Leu, Tyr, His (Tos), Arg, Trp и Gly). Стар Биокемикал (Торранс, Калифорния) (Pro и Ser (tBu), Свинте Тех (Олбани, Орегон), (D-Nal (2). 4,0-4,5 н. растворы HCl в i-PrOH/CH 2 Cl 2 (1/1) получают барботажем HСl в холодный i-PrOH. После насыщения раствора (определено титрованием: приблизительно 9 н.) его сохраняют при комнатной температуре не более 3 дней и разбавляют равным объемом CH 2 Cl 2 перед использованием. 1,0 ммоль N -Boc-Gly-O-полимера из Получения А помещают в реактор автоматизированного твердофазного пептидного синтезатора Века 296 объемом 5,0 л, снабженного вспомогательными пробирками и колбами для прибавления реагентов и для создания повышенного давления, сбрасывания давления и поддержания инертной атмосферы азота. Следующие аминокислоты прибавляют к N -Boc-Gly-O-полимеру путем DIC или HBt содействующего DIC -связывания в течение 3 ч: N -Boc-Pro (2,0 экв,); N -Boc-Arg. HCl (2,0 экв.); N -Boc-Leu, H 2 O (2,0 экв.); N -Boc-D-Nal (2) (1-5 экв.)/HBt; N -Boc-Tyr (1,5 экв,)/HBt; N -Boc-Ser (tBu) (2,0 экв)/HBt; N -Bic-Trp (1,75 экв.)/-HBt; N -Boc-His (Tos) (1,75 экв.)/HBt; (пиро) Glu (2,5 экв.)/-HBt. Для отщепления N -защитной группы после каждого прибавления используют следующие методики. Программа А: полимер вначале промывают CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, ТФК СH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 1 мин, ТФК СH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 30 мин, CH 2 Cl 2 5 х 1 мин, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программа В: полимер вначале промывают CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н HCl в CH 2 CL 2 /i-PrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH 2 Cl 2 /i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Еt 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 мин, ДМФ 1 x 1 мин, СH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программу А используют для отщепления N -защитных групп на Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal (2) и Tyr. Программу В используют для отщепления N -защитных групп на Ser, Trp и His, а также для отщепления защитной группы боковой цепи серина. После осуществления каждой стадии освобождения от защиты и промывки в соответствии с Пpотоколом А или В, следующую аминокислоту в последовательности прибавляют к полипептидной цепи и полимер промывают CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. После построения последовательности пептид отщепляют от полимера путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле при температуре около 25 о С в течение 18 ч. Неочищенный пептид растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-Х4А (Био-Рад), после чего ацетат растворяют в минимальном количестве метанола, и прибавляют ацетон с целью преципитации пептида. Обращеннофазовую ЖХВР (Partisil ODS-3, 40 мкм, ацетонитрил с 0,5% уксусной кислотой) используют для удаления полярных и неполярных примесей. Фракции, содержащие по крайней мере 97% наферелин-ацетата, объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР и промывают 1% уксусной кислотой в воде. Остаток преципицируют, фильтруют, промывают и сушат под вакуумом. Аминокислотный анализ осуществляют на аминокислотном анализаторе Бекман 119СL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют 4 н. раствором CH 3 SO 3 H (0,2% -3-(2-аминометилиндол)HCl) в течение 20 часов при температуре 110 о С. Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием колонки ODS-11 из Олтех, 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыска, расход 1,5 мл/мин, 27,5% CH 3 CN, 72,5% 0,16 М КР 2 РО 4 , рН 5,1, температура 40 о С. ЖХВР анализ неочищенного пептида показывает основной пик с временем удерживания 18 мин в отношении нафарелина и отсутствие примесей в присутствии 1% при величине времени удерживания 14 мин. П р и м е р 2. Синтез нафарелина без защиты серина. Повторяют методику примера 1 за исключением того, что вместо N -Boc-Ser (tBu) используют N -Boc-Ser. ЖХВР -анализ показывает основной пик со временем удерживания 18 минут в отношении нафарелина, а также от 8,1 до 11,5% примеси при времени удерживания (ву) 14 мин. Кроме того, выход в результате этого "незащищенного" синтеза приблизительно равен выходу в результате полностью защищенного синтеза с использованием обработки фтороводородом; в последнем случае выход продукта значительно ниже того, который достигнут в результате синтеза с временной защитой Примера 1. П р и м е р 3. Синтез антагонистов ЛГ-РГ с использованием временной защиты серина. В данном примере антагонисты ЛГ-РГ, N-Ac-D-Nal (2) D-pCl-Phe-Pal (3) Ser-Tyr-D-hArg (Et 2) Leu-hArg (Et 2) Prp-D-Ala NH 2 , получают с использованием следующего протокола защиты боковой цепи: солевая защита относительно L- и D-hArg (Et 2) (в качестве хлорида) и трет-бутиловая защита серина. N -Вос-аминокислоты получают из Бачем (Торранс, Калифорния))D-Ala, Arg и Leu); Стар Биокемикалз (Торранс, Калифорния), (Pro); Синте Тех (Олбани, Орген) (D-Nal (2)), Инцель (Милуоки, Висконсин) (D-Pal (3)) и UCB Бaйопродактс (Бельгия) (p-Cl-Phe). Аминокислоты прибавляют к Na -Boc-D-Ala-полимеру Получения В в следующей последовательности: N -Boc-Pro (2,3 экв.); Na -Boc-hAtg (Et) 2 . HCl (1 экв.)/HBt; Na -Boc-Leu, H 2 O (2,3 экв.); Na -Boc-D-hArg (Et) 2 . HCl (1,6 экв.)/-HBt; Na -Boc-Tyr (2,1 экв.)/HBt; Na -Boc-Ser (tBu) (2,0 экв.); Na -Boc-D-Pal (3) (1,8 экв.)/HBt; Na -Boc-D-p-Cl-Phe (2,0 экв.); Na -Boc-D-Nal (2) (2,1 экв)/HBt; уксусный ангидрид. Ацетилирование осуществляют после Ala, Pro и Leu. Избыток HBt (2 экв.), используют для связывания основных аминоокислот, hArg (Ey) 2 и Pal (3). Аминокислоты присоединяют путем DIC или HBt опосредованного DIC -связывания в течение 3 часов, и полимер последовательно промывают CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и СН 2 Сl 2 4 х 1 мин. Следующий протокол используют для отщепления N -защитной группы после каждого прибавления аминокислот. Программа А: полимер вначале промывают с помощью CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, ТФК CH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 1 мин, ТФК CH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 30 мин, CH 2 Cl 2 5 х 1 мин, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программа B: полимер вначале промывают с помощью CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH 2 Cl 2 /-iPrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH 2 Cl 2 /i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, СH 2 Cl 2 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программу А используют для отщепления защитных групп на Ala. Pro, D-hArg (Et) 2 , Leu и D-Nal (2), Программу В используют для отщепления защитных групп на D-hArg (Et) 2 , Tyr, Ser, D-Pal (3) и p-Cl-Phe. После каждого освобождения от защиты и промывки, в соответствии с протоколом А или В, прибавляют следующую аминокислоту в последовательности и полимер промывают с помощью CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. После завершения cоставления последовательности пептид отщепляют от полимерного носителя путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле в течение приблизительно 18 ч при температуре около 25 о С. Неочищенный пептид вначале растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в его ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-X4A (Био-Рад). Ацетат подвергают хроматографии на колонке силикагеля (CH 2 Cl 2 /i-PrOH/MeOH/H 2 O/HOAc в качестве растворителя); ацетатные фракции растворяют в воде и загружают на обращеннофазную колонку (Vydec c-18, 15-20 мкм) и очищают с использованием ацетонитрила/ТЕАР (рН 3,0). Фракции желательной степени чистоты объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР, затем промывают 1% уксусной кислотой в воде. Пептид десорбируют смесью MeOH/CH 3 CN/HOAc/H 2 O (44/50/1/5). Остаток растворяют в метаноле или уксусной кислоте и преципицируют в присутствии простого эфира, фильтруют, промывают простым эфиром и сушат в вакууме. Аминокислотный анализ осуществляют на анализаторе аминокислотном Бекман 119CL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют с помощью 6 н. раствора HCl при температуре 110 о С в течение 20 ч. Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием Spherisord C-8 (Олтех), 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыск, расход 1,5 мл/мин, 30% СР 3 CN. 70% NH 4 H 2 PO 4 0,04 М, диметилоктиламин 4,3 х 10 -3 , температура 40 о С. Синтез антагониста подтверждают наличием основного пика при времени удерживания 18 мин; других пиков при 1% не обнаружено при времени удерживания 16 мин. П р и м е р 4. Синтез антагониста ЛГ-РГ без временной защиты серина
Повторяют пример 3 с использованием N -Boc-Ser вместо N -Boc-Ser (tBu). ЖХВР -анализ показывает присутствие основного пика при времени удерживания 18 мин относительно антагониста и присутствие примеси при концентрации 6,5% в отношении времени удержания 16 мин. Следующая формула изобретения раскрывает и заявляет предмет технического решения, которое заявитель считает своим изобретением. Приведенная формула изобретения нацелена на полный диапазон эквивалентных решений, признаваемых специалистами в данной области техники, относящейся к твердофазному пептидному синтезу.

Твердофазный синтез пептидов предложен Р. Б. Меррифилдом из университета Рокфеллера (Нобелевская премия 1984 г.). Этот метод основан на сборке пептида на нерастворимой полимерной подложке последовательным присоединением остатков аминокислот с защищенными α -амино- и боковыми группами. План состоял в том, чтобы собирать пептидную цепь постадийно, причем во время синтеза цепь должна быть одним концом привязана к твердому носителю. В результате выделение и очистка промежуточных и целевых производных пептидов сводились просто к фильтрованию и тщательной промывке твердого полимера для удаления всех избыточных реагентов и побочных продуктов, остающихся в растворе.

Термин твердофазный (solid-phase) относится скорее к физическим характеристикам вещества на носителе, так как химическая реакция на полимерном носителе протекает в одной фазе — в растворе. В подходящем растворителе полимер набухает, превращаясь в мало вязкий, но сильно структурированный гель (сшитые полимеры), или же растворяется (в случае не сшитых полимеров), и процесс синтеза происходит на ультрамикрогетерогенном уровне, в практически гомогенной системе.

Для твердофазного органического синтеза требуется полимерная основа — смола S , к которой прикреплен линкер L . На первой стадии к линкеру присоединяют молекулу субстрата А .Молекула А иммобилизуется (т.е. перестает быть мобильной), но сохраняет способность реагировать с другим реагентом В (стадия 2).

Продукт АВ остается на смоле, что позволяет отделить его от избытка реагента В (и побочных продуктов) простым промыванием. (Можно добавлять все новые реагенты, последовательно усложняя исходный субстрат А , главное чтобы линкер в этих реакциях оставался неизменным). Бифункциональный линкер L подбирается так, чтобы его связь со смолой S была более прочна, чем с субстратом А . Тогда на последней стадии целевое соединение AB можно отделить от смолы, разрушив его связь с линкером. Понятно, что связь L -AB должна расщепляться в мягких условиях, не повреждая ни само соединение (связь А -В ), ни контакт линкера со смолой (связь L -S ).

Таким образом, в идеальном случае, промывая смолу после каждой стадии и расщепляя связь с носителем, получают чистое вещество. Естественно полагать, что применение большого избытка реагентов и последующее отделение от смолы во многих случаях позволяют сдвигать химическое равновесие в сторону образования целевого продукта и сократить время синтеза. К недостаткам твердофазного органического синтеза можно отнести необходимость использования достаточно большого избытка (2—30 эквивалентов) реагентов, сложности при идентификации промежуточных продуктов синтеза, а также сравнительно высокую стоимость модифицированных полимерных носителей, которая определяется стоимостью линкера.

Введенный Меррифильдом в практику органического синтеза хлорметилированный полистирол (сшитый небольшим количеством дивинилбензола), так называемая смола Меррифильда, является самым доступным из полимерных носителей.

Методология и основные стадии твердофазного пептидного синтеза

Поставленная задача требует введения полимерного носителя с привитой аминокислотой в реакцию с активированным к замещению гетероциклом. Рассмотрим подробнее методологический аспект получения иммобилизированных аминокислот на полимерных носителях.

Стадия 1. Иммобилизация N-защищенной аминокислоты на полимерный носитель.

Первой стадией нашей схемы является иммобилизация аминокислоты на полимерный носитель. Для того чтобы избежать таких побочных процессов, как образование олигопептидов, аминокислоту предварительно защищают. Как правило, используют N-защищенные аминокислоты, и образующаяся связь между аминокислотой и носителем является связью амидного или сложноэфирного типа.

Наиболее часто применяемыми защитами аминогруппы в твердофазном органическом синтезе являются защитные группы карбаматного типа трет-бутоксикарбонильная (Boc) и 9H-флуоренилметоксикарбонильная защита (Fmoc), X — защищаемая группа:

Необходимо отметить, что выбор защитной группы определяется используемым типом полимерного носителя. Условия иммобилизации защищенных аминокислот различны для различных типов полимерных носителей. Иммобилизация Boc-аминокислот на смолу Меррифильда, представляющую собой хлорметилированный полистирол, проводится in situ в виде цезиевых солей при добавлении суспензии карбоната цезия в диметилфталате (DMF) и каталитических количеств йодида калия. Избыток реагентов по отношению к количеству носителя выбирается в каждом случае индивидуально и составляет 1,5—4 эквивалента.

Иммобилизация Fmoc-аминокислот на полимерный носитель Ванга (X=O) с образованием сложноэфирноголинкера бензильного типа осуществляется карбодиимидным методом при помощи диизопропилкарбодиимида (DIC) в присутствии 4-(диметиламино)пиридина (DMAP) в качестве катализатора. Реакция иммобилизации со стерически незатрудненными аминокислотами протекает при комнатной температуре. Иммобилизация стерически затрудненных аминокислот требует проведения реакции при 40—60 °С в течение 2-х дней и повторного проведения иммобилизации (схема 1).Иммобилизация Fmoc- аминокислот на полимерный носитель Ринка (X=NH) с образованием амидного линкера бензгидрильного типа осуществляется в присутствии реагента Кастро (1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)трис -(диметиламино)фосфония гексафторфосфата (BOP), основания диизопропилэтиламина (DIEA) и 1-гидроксибензотриазола (HOBt), в качестве катализатора. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 2 ч для стерически незатрудненных и 4—6 ч в случае стерически затрудненных аминокислот.

Стадия 2. Деблокирование защищенной аминокислоты на полимерном носителе

На второй планируемой нами стадии (после иммобилизации защищенной аминокислоты) требуется снять защитную группу для активации аминогруппы. Способы снятия Boc- и Fmoc-защиты различны. Удаление Boc-защиты аминокислот на смоле Меррифильда проводится 50%-ной трифторуксусной кислотой в дихлорметане в течение получаса, в этих условияхлинкер Меррифильда остается неповрежденным.

После снятия защиты смолу промывают раствором триэтиламина для удаления трифторуксусной кислоты. Удаление Fmoc-защиты аминокислот на носителях Ванга (X=O) и Ринка (X=NH) проводится 20%-ным раствором пиперидина в DMF течение 40—50 мин.

Значительное уменьшение массы смолы после снятия Fmoc-защиты может служить основой для гравиметрического определения степени иммобилизации защищенных аминокислот на первой стадии твердофазного синтеза. Рекомендуется проводить последовательную обработку смолы раствором пиперидина в диметилфталате— сначала в течение 5—10 мин, затем 30 мин в свежем растворе. После снятия защиты смолу промывают не менее 4-х раз диметилфталатом для отмывки от продуктов разрушения Fmoc-защиты. Контроль за протеканием реакции ацилирования на носителе или удаление защитной функции с аминогруппы возможен с помощью теста Кайзера.

Стадия 3. Нуклеофильное замещение в гетероциклах с участием иммобилизованной на носителе аминокислоты

Следующим этапом, запланированным нами для практической реализации, является проведение реакции ароматического нуклеофильного замещения; нуклеофилом служит привитая аминокислота, а активированный гетероцикл находится в растворе. Большинство реакций нуклеофильного замещения наносителях по выполнению не отличаются от реакций в жидкой фазе. Следует, однако, иметь ввиду, что температура процесса не должна превышать 120 С, выше которой начинает разрушаться полистирольная основа носителя. В условиях проводимой на носителе реакции линкер также должен сохраняться.

Выбирая подходящие активированные гетероциклические субстраты, следует учитывать природу уходящей группы в гетероцикле.

Стадия 4. Снятие целевого соединения с полимерных носителей

Большинство линкеров при твердофазном органическом синтезе расщепляются в кислой среде. Устойчивость линкеров к кислоте резко понижается при переходе от смолы Меррифильда к смоле Ванга и Ринка. Линкер Ринка расщепляется в более мягких условиях (10—20% CF3COOH), чем линкер Ванга (50% CF3COOH).Смола Меррифильда в этих условиях пассивна, и для ее расщепления используют переэтерификацию в растворе NaOMe/MeOH, приводящую к образованию эфира кислоты.

Еще раз напомним, что природа линкера определяет тип терминальной функции в образующейся молекуле, удаляемой с подложки. Смола Ванга позволяет получать кислоты, а смола Ринка — амиды.

Преимущества указанной схемы твердофазного пептидного синтеза:

1. Различные исходные соединения могут быть связаны с отдельными гранулами. Затем эти гранулы смешиваются и, таким образом, все исходные соединения могут взаимодействовать с реагентом в одном эксперименте. В результате продукты реакции образуются на отдельных гранулах. В большинстве случаев, смешивание исходных в традиционной жидкой химии приводит обычно к неудачам - полимеризации или осмолению продуктов. Эксперименты на твердой подложке исключают эти эффекты.

2. Поскольку исходные материалы и продукты связаны с твердой подложной, то избыток реагентов и не связанных с подложкой продуктов можно легко отмыть от полимерной твердой подложки.

3. Можно использовать большие избытки реагентов, для того чтобы провести реакцию до конца (больше, чем 99%), поскольку эти избытки легко отделяются.

4. В случае использования низких объемов загрузок (менее 0,8 ммоль на грамм подложки) можно исключить нежелательные побочные реакции.

5. Интермедиаты в реакционной смеси связаны с гранулами и их нет необходимости очищать.

6. Индивидуальные гранулы полимера могут быть разделены в конце эксперимента и таким образом получаются индивидуальные продукты.

7. Полимерная подложка может быть регенерирована в тех случаях, когда подобраны условия разрыва и выбраны соответствующие якорные группы - линкеры.

8. Возможна автоматизация твердофазного синтеза.

Необходимыми условиями проведения твердофазного синтеза, кроме наличия нерастворимой полимерной подложки, инертной в реакционных условиях, являются:

Присутствие якоря или линкера - химической функции, обеспечивающей связь подложки с наносимым соединением. Он должен быть ковалентно связан со смолой. Якорь также должен являться реакционно-способной функциональной группой для того, чтобы субстраты могли взаимодействовать с ним.

Связь, образующаяся между субстратом и линкером должна быть стабильна в условиях реакции.

Должны существовать способы разрыва связи продукта или интермедиата с линкером.