Сворачивание белка. Почему белковая цепь находит единственно верную укладку среди многих вариантов
Первичная структура белка формируется в результате трансляции белка. По окончании трансляции процесс образования белка не завер- шается. Пептидная цепь претерпевает пространственные изменения, приводящие к ее сворачиванию в правильную трехмерную структуру. Этот процесс является следующим этапом формирования белка и назы- вается фолдингом. Фолдинг включает процессы образования вторичной, третичной и четвертичной структур белка. Фолдинг совершается не одномоментно, а в несколько стадий. Согласно схеме, предложенной О.Б. Птициным (1972г.) он включает следующие этапы:
Случайный белок – пептидная цепь в первичной структуре сразу после трансляции свернута в рыхлый клубок. Все связи между аминокислотными остатками (кроме пептидной) отсутствуют. Такая цепь обладает эластичностью: растягивание ее требует приложения силы, после завершения действия силы цепь возвращается в состоянии клубка.
Предшественник расплавленной глобулы – происходит форми- рование неполной вторичной структуры, за счет взаимодействия всех функционально активных групп аминокислот, кроме радикалов. Цепь принимает определенную пространственную структуру, но частично развер- нута.
Расплавленная глобула – вторичная структура сформирована; на- чинается сжатие цепи в компактную глобулу за счет взаимодействий между радикалами, но окончательно сформированных связей еще нет. Радикалы взаимодействуют с «кем попало», выбирая наиболее правильные позиции. Конфигурация глобулы неустойчива. Жесткой третичной структуры еще нет.
Нативный белок – связи в расплавленной глобуле установились: ра-
дикалыобразовали максимально возможное количество связей: белок нахо- дит оптимально выгодную структуру.
У олигомерных белков фолдинг завершает связывание протомеров в олигомеры.
По времени фолдинг одних белков начинается на стадии трансляции синтеза белка и проходит по мере его роста на рибосоме. Такой фолдинг называется ко-трансляционным. Для других он начинается после завершения трансляции и называется посттрансляционным.
Фолдинг небольших молекул белка определяется первичной структурой данного белка, то есть, последовательностью аминокислот в пептидной цепи, на основе только физико-химических взаимодействий своих химических групп (в частности радикалов). Это подтверждается экспериментом с рибонуклеазой, проведенным К. Анфинсеном в 1973г.
Рибонуклеаза – глобулярный белок, расщепляющий связи между нуклеотидами в РНК. Он состоит из 124 аминокислот, среди которых 8 остатков цистеина образуют 4 дисульфидные связи: 26-84; 40-95; 58-110 и 65-72 (цифры указывают номер остатков цистеина в цепи) (рис.32).
Рис.32. Денатурация и ренативация рибонуклеазы. А – нативная молекула рибонуклеазы, в третичной структуре которой имеются 4 дисульфидные связи; Б – денатурированная молекула рибонуклеазы; В – нативная молекула рибонулеазы, в структуре которой вновь образованы 4 дисульфидные связи между теми же остатками цистеина
Если в среду с рибонуклеазой внести мочевину, (разрывающую водородные связи) и β-меркаптоэтанол (разрывающий дисульфидные связи), то глобулярная нативная структура белка разрушается (денатурация ) и пептидная цепь образует случайный клубок – случайным образом свернутая пептидная цепь в первичной структуре. Ферментативная активность исчезает в связи с разрушением активного центра; белок находится в состоянии, какое он имел до фолдинга. Затем, если оба агента удалить из среды, то восстанавливается нативная структура и фермен- тативная активность белка. Таким образом, происходит ренатурация (восстановление денатурированной структуры белка), ренативация или рефолдинг . Следовательно, строго определенная конформация белка заключена в первичной структуре и для небольших белков определяется только физико-химическим взаимодействием своих химических групп. Белок не только «знает», какую пространственную конфигурацию принять, но и делает это вполне самостоятельно, без дополнительных агентов.
На образование третичной структуры белка могут влиять его лиганды, а также химическая модификация аминокислот.
Фолдинг крупных молекул имеет свои особенности. Так, крупные молекулы белков с большим молекулярным весом и сложной структурой в процессе фолдинга в условиях высокой концентрации белков в клетке могут взаимодействовать друг с другом, за счет своих реакционно-способных радикалов. Гидрофобные радикалы на поверхности молекул склонны к объединению (агрегации), что нарушает ход их правильного фолдинга. Поэтому на время фолдинга реакционноспособные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от аминокислотных остатков других белков. Эту функцию выполняют вспомогательные белки . Они связываются с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации, состоянии, стабилизируют их конформацию и обеспечивают их «правильный» фолдинг.
Такие белки называются факторами фолдинга и делятся на две групппы: фолдазы и шапероны .
nature - природа) - термин биологической химии , означающий потерю белковыми веществами их естественных свойств (растворимости , гидрофильности и др.) вследствие нарушения пространственной структуры их молекул .Процесс денатурации отдельной белковой молекулы, приводящий к распаду её «жёсткой» трёхмерной структуры, иногда называют плавлением молекулы.
Механизмы денатурации
Практически любое заметное изменение внешних условий, например, нагревание или обработка белка кислотой приводит к последовательному нарушению четвертичной, третичной и вторичной структур белка. Обычно денатурация вызывается повышением температуры, действием сильных кислот и щелочей, солей тяжелых металлов, некоторых растворителей (спирт), радиации и др.
Денатурация часто приводит к тому, что в коллоидном растворе белковых молекул происходит процесс агрегации частиц белка в более крупные. Визуально это выглядит, например, как образование «белка» при жарке яиц.
Ренатурация
Ренатурация - процесс, обратный денатурации, при котором белки возвращают свою природную структуру. Нужно отметить, что не все белки способны ренатурировать; у большинства белков денатурация необратима.
См. также
Wikimedia Foundation . 2010 .
Смотреть что такое "Сворачивание белка" в других словарях:
Белок до и после сворачивания Сворачивание белка процесс, аналогичный денатурации белка: в коллоидном растворе белковых молекул под действием внешних воздействий происходит процесс агрегации частиц белка в более крупные. Визуально это выглядит,… … Википедия
Это слово может иметь следующие значения: Сворачивание (программное обеспечение) одна из функций текстового редактора. В биологической химии: Фолдинг белка (англ. folding сворачивание) процесс формирования пространственной структуры… … Википедия
Кристаллы различных белков, выращенные на космической станции «Мир» и во время полётов шаттлов НАСА. Высокоочищенные белки при низкой температуре образуют кристаллы, которые используют для получения модели данного белка. Белки (протеины,… … Википедия
Полимер - (Polymer) Определение полимера, виды полимеризации, синтетические полимеры Информация об определении полимера, виды полимеризации, синтетические полимеры Содержание Содержание Определение Историческая справка Наука о Полимеризация Виды… … Энциклопедия инвестора
Типа Cys2His2 включает альфа спираль и антипараллельную бета структуру. Ион цинка связан кооординационными связями с 2 остатками гистидина и 2 остатками ци … Википедия
Диаграмма двух параллельных белковых альфа спиралей лейциновой застёжки (вид с торца). Лейцин показан как d … Википедия
- (англ. protein sorting, protein targeting) процессы мечения и последующего транспорта белков в живых клетках, которые приводят к попаданию белков в определенные компартменты клетки. Синтезируемые в цитоплазме на рибосомах белки должны… … Википедия
В этой статье не хватает ссылок на источники информации. Информация должна быть проверяема, иначе она может быть поставлена под сомнение и удалена. Вы можете … Википедия
- (от лат. translatio передача), программируемый генами процесс синтеза белка. Посредством Т. осуществляется реализация генетич. информации нуклеиновых к т (см. Генетический код). По совр. представлениям, исходный ген в виде ДНК непосредственно… … Химическая энциклопедия
Книги
- Проблема сворачивания белка. Учебное пособие , Бен-Наим Арье. Проблема сворачивания (фолдинга) белка еще не имеет общепризнанного окончательного решения. В связи с этим данная проблема вызывает интерес исследователей по всему миру. В своей работе автор…
Фолдинг – это процесс укладки вытянутой полипептидной цепи в правильную трехмерную пространственную структуру. Для обеспечения фолдинга используется группа вспомогательных белков под названием шапероны (chaperon, франц. – спутник, нянька). Они предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом, изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы и "убирают" их внутрь молекулы, правильно располагают белковые домены. Шапероны представлены семействами, состоящими из гомологичных по строению и функциям белков, которые отличаются по характеру экспрессии и присутствию в разных компартментах клетки.
В целом шапероны способствуют переходу структуры белков от первичного уровня до третичного и четвертичного, но они не входят в состав конечной белковой структуры.
Новосинтезированные белки после выхода с рибосом для правильного функционирования должны укладываться в стабильные трехмерные структуры и оставаться такими на протяжении всей функциональной жизни клетки. Поддержание контроля качества структуры белка и осуществляется шаперонами, катализирующими укладку полипептидов. Сборка полипротеинов и укладка мультибелковых комплексов также осуществляется шаперонами. Шапероны связываются с гидрофобными участками неправильно уложенных белков, помогают им свернуться и достигнуть стабильной нативной структуры и, тем самым, предотвращают их включение в нерастворимые и нефункциональные агрегаты. В течение своей функциональной жизни белок может подвергаться различным стрессам и денатурации. Такие частично денатурированные белки могут стать, во-первых, мишенью протеаз, во-вторых, агрегировать и, в-третьих, укладываться в нативную структуру с помощью шаперонов. Баланс и эффективность, с которой происходят эти три процесса, определяются соотношением компонентов, участвующих в этих реакциях.
Транспорт многих белков из одного компартмента в другой.
Участие в сигнальных путях. Например, присутствие Hsp70 необходимо для активации фосфатазы, которая путем дефосфорилирования ингибирует протеинкиназу JNK , компонент сигнала стресс-индуцированного апоптоза, т.е. Hsp70 является частью антиапоптозного сигнального пути.
Регуляция функций различных молекул. Например, стероидный рецептор, находящийся в цитоплазме, связан с Hsp90; лиганд, попадающий в цитоплазму, присоединяется к рецептору и вытесняет шаперон из комплекса. После этого комплекс рецептор-лиганд приобретает способность связываться с ДНК, мигрирует в ядро и осуществляет функцию транскрипционного фактора.
При нарушении функции шаперонов и отсутствии фолдинга в клетке формируются белковые отложения – развивается амилоидоз. Амилоид представляет собой гликопротеид, основным компонентом которого являются фибриллярные белки. Они образуют фибриллы, имеющие характерную улырамикроскопическую структуру. Фибриллярные белки амилоида неоднородны. Насчитывают около 15 вариантов амилоидоза.
Прио́ны
Складывается впечатление, что фолдинг с участием фолдаз и шаперонов приводит к правильной. Наиболее оптимальной в энергетическом и функциональном отношениях структкре. Однако это не так. Существует группа тяжелых неврологических болезней, обусловленных неправильным фолдингом одного, вполне определенного белка.
Известно, что PrP может существовать в двух конформациях - «здоровой» - PrPC, которую он имеет в нормальных клетках (C - от англ. cellular - «клеточный»), в которой преобладают альфа-спирали, и «патологической» - PrPSc, собственно прионной (Sc- от scrapie), для которой характерно наличие большого количества бета-тяжей.
Прионный белок, обладающий аномальной трёхмерной структурой, способен прямо катализировать структурное превращение гомологичного ему нормального клеточного белка в себе подобный (прионный), присоединяясь к белку-мишени и изменяя его конформацию. Как правило, прионное состояние белка характеризуется переходом α-спиралей белка в β-слои.
При попадании в здоровую клетку, PrPSc катализирует переход клеточного PrPC в прионную конформацию. Накопление прионного белка сопровождается его агрегацией, образованием высокоупорядоченных фибрил (амилоидов), что в конце концов приводит к гибели клетки. Высвободившийся прион, по-видимому, оказывается способен проникать в соседние клетки, также вызывая их гибель.
Функции белка PrPC в здоровой клетке - поддержание качества миелиновой оболочки, которая в отсутствие этого белка постепенно истончается. В норме белок PrPC ассоциирован с клеточной мембраной, гликозилирован остатком сиаловой кислоты. Он может совершать циклические переходы внутрь клетки и обратно на поверхность в ходе эндо- и экзоцитоза.
До конца механизм спонтанного возникновения прионных инфекций не ясен. Считается (но ещё не полностью доказано), что прионы образуются в результате ошибок в биосинтезе белков. Мутации генов, кодирующих прионный белок (PrP), ошибки трансляции, процессы протеолиза - считаются главными кандидатами на механизм возникновения прионов.
Таким образом, прио́ны - особый класс инфекционных агентов, чисто белковых, не содержащих нуклеиновых кислот, вызывающих тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных (т. н. «медленные инфекции»).
Есть данные, дающие основание считать, что прионы являются не только инфекционными агентами, но и имеют функции в нормальных биопроцессах. Так, например, существует гипотеза, что через прионы осуществляется механизм генетически обусловленного стохастического старения.
Прионы - единственные известные инфекционные агенты, размножение которых происходит без участия нуклеиновых кислот.
Во второй половине XX века врачи столкнулись с необычным заболеванием человека - постепенно прогрессирующим разрушением головного мозга, происходящим в результате гибели нервных клеток. Это заболевание получило название губчатой энцефалопатии. Похожие симптомы были известны давно, но наблюдались они не у человека, а у животных (скрейпи овец), и долгое время между ними не находили достаточной обоснованной связи.
Новый интерес к их изучению возник в 1996 г., когда в Великобритании появилась новая форма заболевания, обозначаемая как «новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба.
Важным событием было распространение «коровьего бешенства» в Великобритании, эпидемия которого была сначала в 1992-1993 гг, а потом и в 2001 г охватила несколько европейских государств, но тем не менее экспорт мяса во многие страны не был прекращён. Заболевание связывают с использованием «прионизированной» костной муки в кормах и премиксах, изготовленной из туш павших или заболевших животных, возможно, и не имевших явных признаков заболевания.
Пути переноса причинного фактора болезни, механизмы проникновения прионов в организм и патогенез заболевания изучены пока недостаточно.
Прионы млекопитающих - возбудители губчатой энцефалопатии
Скрейпи овцы и козы Прион скрейпи OvPrPSc
Трансмиссивная энцефаломиопатия норок (ТЭН) Прион ТЭН и MkPrPSc
Chronic wasting disease (CWD) олени и лоси CWD прион MDePrPSc
Губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭКРС) Коровы Прион ГЭКРС BovPrPSc
Губчатая энцефалопатия кошачьих (ГЭК) Кошки Прион ГЭК FePrPSc
Губчатая энцефалопатия экзотических копытных (EUE) Антилопы и большой куду EUE прион NyaPrPSc
Куру Люди Прион куру HuPrPSc
Болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ) Люди Прион БКЯ HuPrPSc
(New) Variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD, nvCJD) Люди vCJD прион HuPrPSc
Синдром Герстманна-Штройслера-Шейнкера (GSS) Люди GSS прион HuPrPSc
Фатальная семейная бессонница (ФСБ) Люди Прион ФСБ HuPrPS
Человек может заразиться прионами, содержащимися в пище, так как они не разрушаются ферментами пищеварительного тракта. Так как стенками кишечника они не адсорбируются, то могут проникать в кровь только через поврежденные ткани. В конечном итоге они попадают в центральную нервную систему. Так переносится новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (nvCJD), которой люди заражаются после употребления в пищу говядины, содержащей нервную ткань из голов скота, больных бычьей губчатой энцефалопатией (BSE, коровье бешенство).
На практике доказана возможность прионов заражать организм мышей воздушно-капельным путем.
Прионы могут проникать в тело и парентеральным путем. Были описаны случаи заражения при внутримышечном введении препаратов, изготовленных из человеческих гипофизов (главным образом гормоны роста для лечения карликовости), а также заражение мозга инструментами при нейрохирургических операциях, поскольку прионы устойчивы к применяемым в настоящее время термическим и химическим методам стерилизации. Эта форма болезни Крейтцфельдта-Якоба обозначается как ятрогенная (1CJD).
При определённых, неизвестных условиях, в организме человека может произойти спонтанная трансформация прионного белка в прион. Так возникает так называемая спорадическая болезнь Крейтцфельдта-Якоба (sCJD), впервые описанная в 1920 г. независимо друг от друга Гансом Герхардом Крейтцфельдтом и Альфонсом Марией Якобом. Предполагается, что спонтанное возникновение этой болезни связано с фактом, что в норме в человеческом теле постоянно возникает небольшое количество прионов, которые эффективно ликвидируются клеточным Аппаратом Гольджи. Нарушение этой способности «самоочищения» клеток может привести к повышению уровня прионов выше допустимой границы нормы и к их дальнейшему неконтролируемому распространению. Причиной возникновения спорадической болезни Крейтцфельдта-Якоба согласно этой теории является нарушение функции Аппарата Гольджи в клетках.
Особую группу прионовых заболеваний представляют собой наследственные (врожденные) болезни, вызванные мутацией гена прионового белка, который делает возникший прионовый белок более подверженным спонтанному изменению пространственной конфигурации и превращения их в прионы. К этой группе наследственных заболеваний относится и наследственная форма болезни Крейтцфельдта-Якоба (fCJD), которая наблюдается в ряде стран мира. При прионовой патологии наивысшая концентрация прионов обнаружена в нервной ткани заражённых людей. Прионы встречаются в лимфатической ткани. Наличие прионов в биологических жидкостях, включая слюну, пока не было однозначно подтверждено. Если представление о постоянном возникновении небольшого количества прионов верно, то можно предположить, что новые, более чувствительные методы диагностики откроют это количество прионов, разбросанное по различным тканям. В данном случае, однако, речь пойдёт о «физиологическом» уровне прионов, которые не представляют собой никакой угрозы для человека.
Это биологические молекулы, выполняющие тысячи специфических функций внутри каждой клетки живого организма. Белки синтезируются в рибосомах в виде длинной полипептидной нити, но затем быстро сворачиваются в свою естественную («нативную») пространственную структуру. Этот процесс называется фолдинг белка. Может показаться удивительным, но этот фундаментальный процесс до сих пор плохо понят на молекулярном уровне. В результате предсказать нативную структуру белка по его аминокислотной последовательности пока не удается. Для того чтобы почувствовать хотя бы некоторые нетривиальные аспекты этой задачи, попытаемся решить ее для следующей исключительно простой модели белковой молекулы.
Пусть белок состоит из совершенно одинаковых звеньев, последовательно соединенных друг с другом (рис. 1). Эта цепочка может изгибаться, и для простоты будем считать, что она изгибается не в пространстве, а только в плоскости. Цепочка имеет определенную упругость на изгиб: если направления двух соседних звеньев образуют угол α (измеряемый в радианах), то такое соединение повышает энергию молекулы на A α 2 /2, где A - некоторая константа размерности энергии. Пусть также у каждого звена по бокам имеется два «контактных участка», которыми звенья могут склеиваться. Каждая такая склейка обладает энергией –B (то есть она понижает энергию цепочки на величину B ). Наконец, будем предполагать, что B меньше A (то есть цепочка достаточно упруга).
Задача
Какая конфигурация молекулы из N звеньев будет наиболее энергетически выгодной? Исследуйте , как меняется эта конфигурация с ростом N .
Подсказка
Наиболее энергетически выгодной является конфигурация с минимальной энергией. Поэтому надо придумать, как устроить большое число «склеек» звеньев (каждая их которых понижает энергию), но при этом не слишком резко изгибать цепочку, чтобы чересчур сильно не увеличивать ее упругую энергию.
В этой задаче не требуется искать абсолютно точную форму цепочки для каждого конкретного числа звеньев. Надо лишь описать характерные «узоры», которые будут возникать при оптимальном фолдинге этой «белковой молекулы», и найти, при каком примерном N молекуле выгодней перестроиться из одной конфигурации в другую.
Решение
Энергия абсолютно прямой цепочки равна нулю. Для того чтобы понизить ее, некоторые звенья должны слипнуться. Но для этого цепочка должна организовать петлю, и наличие петли повышает энергию. Если петля слишком длинная, то большое количество звеньев, которые могли бы связаться друг с другом, остаются без связи. Эти звенья можно соединить, словно на застежке-молнии, укоротив тем самым петлю, но от этого увеличится ее энергия упругости. Поэтому надо найти такую оптимальную длину петли, при которой силы упругости, расширяющие петлю, и силы связи, ее «застегивающие», сбалансированы.
Энергия петли
Пусть имеется петля из m несклеенных звеньев (рис. 2). Характерный угол между соседними звеньями в ней - примерно 2π/m . (На самом деле, этот угол меняется от звена к звену, поскольку наиболее выгодная форма петли вовсе не круговая, но для приближенного исследования наша оценка вполне пойдет.) Таких соединений имеется m штук, поэтому петля обладает энергией 2π 2 A /m . Застегнем ее еще на одно звено. Тогда петля станет короче на два звена, а энергия всей цепочки изменится на величину
Если же, наоборот, разорвать одну связь, то энергия цепочки изменится на
Петля из m звеньев является оптимальной, когда оба эти изменения энергии положительны, то есть с энергетической точки зрения петлю невыгодно ни удлинять, ни укорачивать. Поскольку B много меньше A , ясно, что величина m получится значительно больше единицы. Поэтому для примерной оценки оптимального m эти два неравенства можно заменить одним равенством:
Таким образом, оптимальная длина петли примерно равна
Во всех последующих формулах под буквой m будет подразумеваться именно оптимальная длина петли. Наконец, полезно найти энергию упругости такой оптимизированной петли; она получается равной
Это выражение (энергия петли в m /2 раз больше величины B ) очень удобно для дальнейших вычислений.
Когда появляется петля?
Теперь легко выяснить, при цепочке какой длины будет выгоднее не оставаться прямой, а свернуться в петлю с «двойным хвостиком» длины n . Для этого нужно, чтобы полная энергия такой конфигурации была отрицательна:
Таким образом, если длина цепочки N > m + 2(m /2) = 2m , то ей выгоднее образовать петлю.
Когда появляется вторая петля?
«Двойной хвостик» - это не максимально удобная конфигурация, поскольку в каждом звене «работает» только один из контактных участков, а хотелось бы, чтоб работали оба, хотя бы у некоторых звеньев. Это можно устроить, образовав вторую петлю (рис. 3).
Условие для перехода к двумя петлям, E 1 > E 2 , тогда даст N > 8m .
Очень длинная цепочка
Когда цепочка становится очень длинной, ее удобно сворачивать так, чтобы как можно большее количество звеньев было склеено обоими своими контактными участками. Таким образом мы получаем конфигурацию, напоминающую обрамленное петельками полотно. Если закрыть глаза на то, что соседние петли мешают друг другу, можно провести аналогичное вычисление и найти наиболее выгодное количество петель для заданного N (оно растет пропорционально квадратному корню из N ). Если же учесть, что петли мешают друг другу, то вычисления резко усложнятся. Однако общая структура останется той же: наиболее выгодным будет плоское полотно некоторой формы, обрамленное по краям петельками. Желающие могут попробовать найти оптимальную форму полотна с помощью компьютерного моделирования, а также поразмышлять над аналогичной задачей в трехмерном пространстве.
Послесловие
Эта простая задача, конечно же, не может отразить ни закономерностей фолдинга настоящих белковых молекул, ни тех методов современной теоретической физики, которые применяются при описании белков и полимеров (эта область деятельности, кстати, является вполне серьезным разделом физики конденсированных сред). Цель этой задачи состояла лишь в демонстрации того, как «количество переходит в качество», то есть как при изменении лишь одного численного (а не качественного) параметра задачи может принципиально меняться ее решение.
Задачу можно было бы сделать чуть более «живой» и интересной, если ввести ненулевую температуру. В этом случае оптимальная конфигурация определялась бы не только энергией, но и энтропией, она бы тогда отвечала минимуму так называемой свободной энергии молекулы. При изменении температуры тогда происходил бы настоящий фазовый переход, при котором молекула сама бы распрямлялась, сворачивалась или перестраивалась из одной формы в другую. К сожалению, такая задача потребует методов, которые выходят за рамки школьной программы.
Любопытно также заметить, что теоретическое изучение фолдинга белков вовсе не сводится к одному лишь численному моделированию. В этой, казалось бы, «прямолинейной» задаче вскрываются довольно нетривиальные математические тонкости . Более того, имеются даже работы , в которых для описания этого процесса привлекаются методы квантовой теории поля и теории калибровочных взаимодействий.
Потренироваться на практике в поиске оптимальной конфигурации белка можно на сайте Fold.it .
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Белки - главные биологические молекулы. Они выполняют множество разнообразных функций: каталитическую, структурную, транспортную, рецепторную и многие другие. Даже всем известная ДНК играет лишь роль «флешки», храня информацию о белках, в то время как белки - сами «файлы». Жизнь на Земле по праву можно назвать белковой. Но так ли много мы знаем о структуре и функционировании этих веществ? До сих пор тайной остается фолдинг белка - процесс пространственной упаковки белковой молекулы, принятия белком строго определенной формы, в которой он выполняет свои функции.
Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу , стал предприниматель Константин Синюшин , за что ему огромный человеческий респект!
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас ».
Спонсор публикации этой статьи - Лев Макаров.
Белки - биополимеры, которые можно сравнить с бусами, где бусинами являются аминокислоты, соединенные между собой пептидными связями (отсюда другое название белков - полипептиды). В клетке белки синтезируются на специальных молекулярных машинах - рибосомах . Выходя из рибосомы, полипептидная цепь сворачивается, и белок принимает определенную конформацию, то есть пространственную структуру (рис. 1). Жизненно важно, чтобы белок присутствовал в организме в определенной форме, то есть конформация должна быть «правильной» (нативной). Процесс сворачивания белка и называется фолдингом (от англ. folding - сворачивание, укладка; отметим, что термин «фолдинг» применим не только к белкам). Самое интересное, что информация о трехмерной структуре «заложена» в самой последовательности аминокислот. Таким образом, белку, чтобы принять нативную структуру, требуется лишь «знать», в какой последовательности и какие аминокислотные остатки в нем присутствуют. Впервые это было доказано в 1961 году Кристианом Анфинсеном на примере бычьей панкреатической рибонуклеазы (рис. 2). Следует сказать, что, помимо белков, чья пространственная структура строго определяется аминокислотной последовательностью, существуют так называемые неструктурированные белки (intrinsically unfolded proteins, IDPs ): некоторые фрагменты таких молекул, а иногда и целые молекулы, способны принимать сразу множество возможных конформаций, причем все они энергетически «равноценны», а такие белки довольно часто встречаются в природе и выполняют важные функции . Существует и другой тип фолдинга, происходящий с помощью специальных белков - шаперонов , но о нем чуть позже.
Рисунок 1. Котрансляционный фолдинг маленького α-спирального домена. Сворачивание полипептидной цепи многих белков начинается уже в рибосоме во время трансляции белка (то есть его синтеза). Созревающий белок выходит из рибосомы через специальный туннель (на рисунке - затемненная область в большой субъединице), который является важным фактором сворачивания цепи , причем С-конец цепи (содержащий карбоксильную группу) фиксирован в рибосоме, а N-конец (содержащий аминогруппу) «продвигается» к выходу и «свисает» из него, когда в туннеле накапливается 30–40 аминокислотных остатков . В туннеле могут формироваться компактизированные незрелые структуры, α-спирали, β-шпильки и маленькие α-спиральные домены . Котрансляционный фолдинг проходит в две стадии: сначала несвернутая цепь (U, unfolded ) переходит в компактизированное состояние (C, compacted ), которая затем приобретает нативную структуру (N, native ).
Рисунок 2. Бычья панкреатическая рибонуклеаза и ученые, которые ее изучали. а - Бычья панкреатическая рибонуклеаза. За исследование структуры этого фермента Анфинсен (Anfinsen ) (б ), Мур (Moore ) (в ) и Стайн (Stein ) (г ) получили Нобелевскую премию по химии (1972 г.) , . На примере этого белка впервые было показано явление рефолдинга - самопроизвольного формирования третичной структуры после денатурации (то есть разрушения) . Значение белкового фолдинга заключается в том, что он приводит к формированию строго определенной (нативной) структуры белка, в которой он функционирует. Например, в опыте Анфинсена рибонуклеаза в результате рефолдинга восстановила свою ферментативную активность, то есть стала вновь хорошо катализировать биохимическую реакцию. Для того чтобы этот фермент работал, в единый каталитический центр (один кусочек пространства) должны из совершенно разных мест белковой цепи собраться пять аминокислотных остатков: гистидин (12), лизин (41), треонин (47), гистидин (119) и фенилаланин (120) .
модель из базы данных PDB (PDB ID 5D6U), портреты ученых с сайта ru.wikipedia.org
Актуальность проблемы
Проблема заключается в том, что человечество со всеми своими вычислительными мощностями и арсеналом экспериментальных данных до сих пор не научилось строить модели, которые бы описывали процесс белкового фолдинга и предсказывать трехмерную структуру белка на основе его первичной структуры (то есть аминокислотной последовательности). Таким образом, полного понимания этого физического процесса до сих пор нет.
Взрывной рост геномных проектов привел к тому, что секвенируется все больше геномов, а соответствующие последовательности ДНК и РНК наполняют базы данных по экспоненте. На рис. 3 изображены рост числа аминокислотных последовательностей, а также рост числа известных белковых структур в период с 1996 по 2007 годы. Хорошо видно, что число известных структур значительно меньше, чем число последовательностей. На момент написания настоящей статьи (август 2016 г.) число последовательностей в базе данных UniParc составляет более 124 миллионов, в то время как количество структур в базе данных PDB (Protein Data Bank ) - лишь чуть больше 121 тысячи, что составляет менее 0,1% от всех известных последовательностей, причем разрыв между двумя этими показателями стремительно нарастает и, вероятно, будет расти и дальше. Такое сильное отставание связано с относительной сложностью современных методов определения структур . При этом знать их очень важно. Поэтому вопрос применения вычислительных методов с целью предсказания белковых структур по их последовательностям стоит сейчас остро. В 2005 году авторитетный журнал Science признал проблему фолдинга белка одной из 125 крупнейших проблем современной науки .
Рисунок 3. Сравнение темпов роста числа известных последовательностей и структур с 1996 по 2007 годы. На горизонтальной оси указываются годы, на левой вертикальной - число последовательностей в миллионах (сплошная линия ), на правой вертикальной - число структур в миллионах (пунктирная линия ). Четко видно отставание количества известных структур от количества последовательностей. К настоящему моменту разрыв вырос еще сильнее.
После прочтения генома человека стали известны многие человеческие гены и, следовательно, аминокислотные последовательности, кодируемые ими . Однако это не значит, что мы знаем функции всех генов, иначе говоря, мы не знаем функции белков, кодируемых этими генами. Известно, что во многом функции белков можно предсказать по их структуре, хоть и не всегда , . Поэтому заветной мечтой является способность предсказывать структуру и, как следствие, функцию белка по самой нуклеотидной последовательности гена.
Что делается для решения проблемы?
Неверно, однако, думать, что мы не знаем совсем ничего. Конечно, накоплено большое количество фактов о фолдинге, известны закономерности этого процесса, разработаны различные методы его моделирования , . Чтобы отслеживать успехи, достигаемые на пути к решению проблемы фолдинга, был создан международный конкурс по предсказанию пространственной структуры белковых молекул - CASP (Critical Asessement of techniques for protein Structure Prediction ), проходящий раз в два года (сейчас соревнование проходит в двенадцатый раз, оно началось в апреле и закончится в декабре 2016 года). В этом состязании исследователи соревнуются, кто лучше предскажет структуру белка по его аминокислотной последовательности, причем конкурс проходит с использованием двойного слепого метода (на момент проведения конкурса структура белка-«загадки» попросту неизвестна; ее определение завершается каждый раз по окончании состязания). Пока что структуры белков-мишеней точно не были предсказаны ни разу.
Существует две группы методов предсказания структуры.
К первой относятся так называемые методы моделирования «с нуля» (ab initio, de novo , есть и другие синонимичные термины), когда модели строятся лишь на основании первичной структуры, без использования сравнительных методов с уже известными структурами, зато с использованием всего накопленного понимания физики сворачивания биополимеров. Фундаментальная значимость этих методов состоит в том, что они помогают понять физико-химические принципы белкового фолдинга, ответить на этот животрепещущий вопрос - почему белок сворачивается так, а не иначе? Однако недостатками этих методов являются очень большая сложность вычисления и невысокая точность . Эти методы требуют упрощений и приближений, а также являются неэффективными для предсказания структур крупных белков. В 2007 году за счет методов моделирования de novo впервые с высокой точностью была определена структура одного из белков бактерии Bacillus halodurans , но белок этот относительно невелик (112 аминокислотных остатков), а для получения точной модели потребовалась мощность более 70 000 персональных компьютеров и суперкомпьютера; кроме того, из 26 полученных моделей точной оказалась лишь одна . Методы молекулярной динамики (МД) позволяют описывать молекулярные события и способны проследить процесс сворачивания белка в нативную структуру: в 2010 году впервые удалось это сделать за счет вычислительной мощности специально созданного суперкомпьютера Anton .
Ко второй группе методов относятся методы сопоставительного моделирования . Они основываются на явлении гомологии , то есть общности происхождения объектов (органов, молекул и др.). Таким образом, у «предсказателя» есть возможность сравнивать последовательность белка, структуру которого необходимо смоделировать, с шаблоном, то есть белком, структура которого известна и который предположительно является гомологом, и на основании их схожести строить модель с последующими корректировками (похожие последовательности сворачиваются в похожие структуры). Эти методы сейчас более популярны, так как предсказание структуры белков является важной практической задачей, а к настоящему моменту появились вычислительные средства, базы данных, а также стало известно, что количество возможных вариантов укладок белковых структур ограничено , (рис. 4). И пусть эти методы не снимают самой проблемы белкового фолдинга, они способны помочь решать конкретные практические задачи, пока другие бьются над исследованием более фундаментальных вопросов.
Рисунок 4. Динамика выявления новых типов фолдов (вариантов упаковки). На горизонтальной оси откладывается время (годы), на левой вертикальной оси - доля новых фолдов (более детально - на вкладке) (сплошная линия ), а на правой вертикальной оси - общее число структур (пунктирная линия ), классифицированных в базе данных CATH . Отметим, что эта база данных занимается структурной классификацией белков, поэтому для нее принципиально знать возможные типы белковых фолдов. Явно видно, что со временем классифицируется все больше и больше белков, но при этом количество вариантов фолдов уменьшается.
Нужно подчеркнуть, что современные методы предсказания белковых структур требуют большой вычислительной мощности и часто осуществляются на суперкомпьютерах или с помощью сетей распределенных вычислений , как, например, Rosetta@home и Folding@home . К участию в работе этих проектов приглашаются все желающие: нужно лишь запустить программу на своем компьютере, пока он не нужен пользователю.
Некоторые закономерности фолдинга белка
Известны некоторые закономерности белкового фолдинга. Сейчас считается, что этот процесс происходит поэтапно: сначала линейная цепочка, имеющая нулевую энтропию, быстро сворачивается с образованием статистического клубка - энтропийное сворачивание . Затем происходит гидрофобный коллапс : гидрофобные аминокислотные остатки «прячутся» вглубь молекулы, а гидрофильные - «расселяются» по поверхности (см. ниже). Результатом этого этапа является формирование расплавленной глобулы . После этого происходит формирование специфических связей (см. ниже), и белок переходит в состояние истинной глобулы , при этом свободная энергия резко падает .
Последний этап не происходит при фолдинге неструктурированных белков - IDPs .
Нужно отметить, что для каждой аминокислотной последовательности теоретически можно предположить множество путей, которыми она может идти для достижения нативной конформации. Однако известно, что белок не перебирает все возможные варианты, а движется по одному из возможных путей, определенных для каждой последовательности. Если бы белок пробовал все возможные варианты, то время пути от простой последовательности к нативному состоянию превысило бы время существования Вселенной (парадокс Левинталя)! Конечно, такого не происходит: время принятия белком нативной структуры составляет доли секунды. Это похоже на сборку кубика Рубика: из состояния несобранного кубика к состоянию собранного можно прийти множеством разнообразных путей, однако на соревнованиях по скорости сборки кубика побеждает тот, кто делает это быстрее и эффективнее, то есть выбирает определенный путь. На самом деле найти такой путь - и есть главная задача методов моделирования ab initio (см. выше). Ответ на фундаментальный вопрос фолдинга будет заключаться не просто в способности безошибочно моделировать структуры, а, в первую очередь, в том, чтобы знать и обосновывать путь достижения белком нативного состояния.
Следует подчеркнуть значение котрансляционного фолдинга (рис. 1), о котором говорилось выше, в формировании структуры белка. Отметим, что присутствие рибосомы, на которой синтезируется белок, накладывает серьезные коррективы на процесс сворачивания цепочки. Это всегда нужно иметь в виду при моделировании фолдинга природных белков in vivo . Канал, в котором оказывается растущая цепь, ограничивает ее конформационную изменчивость, а потому далеко не все типы структур могут в ней формироваться , . Кроме того, растущая цепочка постоянно проталкивается вперед (на один аминокислотный остаток при каждом акте транспептидации-транслокации, то есть образования новой пептидной связи и последующего продвижения рибосомы), а потому логично будет предположить, что конформация цепи в рибосомном канале обладает такими качествами, как жесткость и векторность, что соответствует свойствам α-спирали . Кроме того, взаимная ориентация аминокислотных остатков в двух центрах внутри рибосомы всегда однотипная (эквивалентная), не зависящая от природы этих остатков, что тоже, по-видимому, способствует формированию α-спиралей . Действительно, α-спирали - наиболее типичный элемент вторичной структуры белков. Они были открыты Лайнусом Полингом (Liunus Pauling ) и Робертом Кори (Robert Corey ), которые вместе с Уолтером Колтуном (Walter Koltun ) предложили новый тип моделей молекул .
В то же время, когда N-конец (содержащий аминогруппу) растущей цепи белка выходит из туннеля и погружается в раствор, на него начинают действовать физико-химические условия этой среды, и белок начинает подчиняться их правилам.
Известный молекулярный биолог академик Александр Спирин в этой связи отмечает три различия между фолдингом in vitro и in vivo :
- Во-первых, различна стартовая конформация: если в экспериментальных условиях ренатурация начинается с некоего состояния развернутой цепочки в растворе, то в случае с рибосомой фолдинг начинается уже с какой-то определенной конформации, обеспеченной рибосомальным каналом.
- Во-вторых, при котрансляционном фолдинге сворачивание начинается с N-конца, то есть процесс фолдинга направленный, а в случае фолдинга без участия рибосомы поиск конформаций осуществляется сразу всей молекулой.
- Третье отличие заключается в том, что в случае котрансляционного фолдинга C-конец белковой цепи фиксирован рибосомой, относительно крупной частицей, что приводит к стабилизации промежуточных структур (см. выше), а в случае рефолдинга in vitro такой стабилизации не происходит.
Эти соображения лишний раз доказывают, что биологические вопросы не могут решаться «всухую» за счет применения методов биоинформатики . Даже самые, казалось бы, выверенные компьютерные модели могут оказаться неточны, если они построены без учета факторов, реально действующих в природе.
Для решения проблемы фолдинга разработаны так называемые эмпирические потенциалы: парных взаимодействий остатков, водородных связей, торсионных углов, центров масс боковых цепей и многие другие , . Например, потенциал сольватации позволяет предсказать, внутри или снаружи белка будет находиться аминокислотный остаток (соответственно заглубленный или экспонированный) в зависимости от его гидрофобности , . Известно, что одни аминокислоты «любят» воду (гидрофильные ), они будут с большей вероятностью располагаться на поверхности белковой молекулы, а другие - «не любят» (гидрофобные ) и «прячутся» в более недоступные для растворителя области молекулы, заслоняясь другими остатками (рис. 5). Гидрофобный эффект имеет большое значение в фолдинге белка.
Рисунок 5. Гидрофобность аминокислот влияет на их пространственное распределение (на примере одной из человеческих дегидрогеназ). Гидрофильные аминокислоты показаны синим цветом , гидрофобные - красным . Можно заметить, что гидрофильные остатки стремятся располагаться на открытых для растворителя участках, в то время как гидрофобные - в закрытых областях молекулы.
база данных PDB (PDB ID 5ICS)
Важным аспектом формирования структуры белка на всех этапах является образование связей между радикалами (боковыми цепями) аминокислотных остатков. Они бывают разные: гидрофобные, электростатические и другие . Интересным вариантом является формирование дисульфидных связей («мостиков») за счет взаимодействия атомов серы боковых цепей цистеина. Например, в прославленной рибонуклеазе, за исследование структуры которой была дана Нобелевская премия, таких связей четыре. Однако здесь все не так просто. Если в состав белковой цепи входят два атома серы, принадлежащие цистеину, то легко сказать, что может образоваться один дисульфидный мостик. Но если атомов серы, к примеру, десять и, соответственно, образуются пять SS-связей, то мы не можем однозначно сказать, какие именно атомы серы будут попарно взаимодействовать друг с другом (а белок может). Согласно расчетам Томаса Крейтона (Thomas Creighton ), если в белке 5 дисульфидных связей, число возможных комбинаций составляет уже 945, если таких связей 10, то число вариантов составляет 654 729 075, а при 25 дисульфидных связях это число превышает 5 квадриллионов квадриллионов (более 5,8 × 10 30) . А в белке реализуется лишь один вариант, и притом всегда один и тот же! Следует тем не менее отметить, что это справедливо для самоорганизации белков in vitro («в пробирке», «в стекле», то есть в условиях эксперимента, а не в живом организме) в подходящих условиях, а in vivo (в живом организме) самоорганизации дисульфидных связей не происходит. Их образование катализирует специальный фермент - протеиндисульфидизомераза , или ПДИ , которая к тому же способна «исправлять» ошибки в случае неправильного образования SS-связи, таким образом корректируя процесс фолдинга , .
Важно понимать, что процесс формирования окончательной структуры белка не заключается лишь в простом сворачивании цепочки. В клетках белки подвергаются ацетилированию, гликозилированию и многим другим модификациям. Поэтому, например, количество разных аминокислот в белках превышает известные 20 («магическая двадцатка», по образному выражению нобелевского лауреата Фрэнсиса Крика). Кроме того, для формирования сложных (олигомерных) белков необходимо формирование специфических связей между отдельными протомерами (например, в молекуле гемоглобина четыре протомера, то есть отдельно синтезированные цепочки). Для многих белков, особенно ферментов, важным является присоединение простетической группы, то есть небелкового компонента. Могут происходить и другие преобразования .
Известны многие другие закономерности белкового фолдинга. Завеса тайны постепенно приподнимается. Однако картина до сих пор далека от целостной. Успехи предсказания структур пока только эпизодические. В связи с этим научное сообщество сделало следующий любопытный шаг: оно привлекло к решению вопроса широкую общественность, создав игру FoldIt , . Принять участие в мировом соревновании может любой желающий. Суть игры заключается в том, чтобы свернуть белковую цепочку максимально компактно, то есть привести белковую молекулу в такое состояние, в котором свободного места внутри клубочка как можно меньше - именно в таком виде белки присутствуют в природе (рис. 6). С точки зрения термодинамики, такому состоянию соответствует минимум свободной энергии , . Чем более компактная молекула получается, чем меньше полостей и открытых гидрофобных участков, чем больше открытых гидрофильных участков, водородных связей в структурах типа β-листов, чем меньше «столкновений» атомов, тем большее количество баллов игроку начисляется. Таким образом, наибольшее количество баллов получает модель с наименьшей свободной энергией. Большинство игроков FoldIt имеют лишь малую биохимическую подготовку либо не имеют ее вовсе . Игра основана на алгоритмах Rosetta и не является моделированием структур de novo , которое, как верно подмечают авторы, все еще остается исключительно сложной проблемой .
Рисунок 6. Сравнение разных форм представления моделей белковых структур (на примере одной из человеческих трансфераз). а - Форма, наглядно демонстрирующая типы вторичных структур. б - Форма, показывающая реальное расположение атомов молекулы белка в пространстве (Space Fill ). Хорошо видно, что молекулы белков сильно компактизированы, между атомами мало свободного пространства.
база данных PDB (PDB ID 5CU6)
Группа игроков FoldIt принимает участие в CASP . Игра уже показала свою эффективность в предсказании структур и даже бóльшую эффективность в сравнении с другими методами, а также решила серьезную научную проблему структуры протеазы вируса иммунодефицита обезьян, которую наука не могла решить на протяжении более чем десятилетия .
Говоря о применении разных методов и средств для решения обсуждаемой проблемы, всегда нужно помнить, что не все последовательности могут сворачиваться строго определенным образом. Вероятно, мы, глядя на результаты, к которым пришла эволюция к настоящему времени, видим только те последовательности, которые могут сворачиваться, поскольку они хорошо выполняли свои функции и были поддержаны отбором.
«Гувернантки» для белков - шапероны
Говоря о фолдинге, мы акцентировали внимание на относительной автономности этого процесса: белковая молекула принимает определенную конформацию на основании своей первичной структуры, и происходит это в конкретных (что важно) физико-химических условиях (кислотность, температура, природа растворителя и др.). Тем не менее не должно складываться впечатление, будто бы фолдинг абсолютно независим, особенно для крупных белков. Мы лишь упомянули о ферменте ПДИ, помогающем белку правильно свернуться. Кроме этого фермента, есть и другие (например, ППИ - пептидил-пролил-цис/транс-изомераза , ). Но ферменты - не единственная группа белков, помогающая правильно сворачиваться другим белкам. Существует еще одна особая группа белков, играющих важную роль в фолдинге. Называются они шаперонами .
Шапероны - сложные белки с консервативным (то есть эволюционно малоизменчивым) механизмом действия, встречающиеся во всех царствах живой природы. Это и понятно: их роль в жизнедеятельности клетки огромна . Как говорилось выше, созревающая белковая цепочка выходит из рибосомы. Она еще незрелая, а пребывает в так называемом «расплавленном» состоянии. Такие незрелые молекулы подвержены дурному влиянию окружения: они могут взаимодействовать с другими клеточными белками, образуя агрегаты, что может приводить к болезням, например, болезни Альцгеймера или Паркинсона. Но есть и «правильное» русло, по которому может (и должно) быть направлено развитие белка, - тот путь, который приведет расплавленную глобулу в нативное состояние. Тут и помогают шапероны, «подкарауливая» и захватывая белковые цепочки у самого выхода из рибосомного туннеля и таким образом направляя незрелые белки, находящиеся на судьбоносном перепутье, в верное русло. Шапероны названы так неспроста: раньше в Англии так называли пожилую опытную даму, которая сопровождала молодую девушку, впервые вышедшую в свет под ее руководством, и удерживала ее от непродуманных контактов . (Термин «шаперон» и сейчас используется в близких значениях.) Шапероны не являются специфичными для разных аминокислотных последовательностей зарождающихся цепей, но они могут отличать зрелые белки от незрелых и действуют на последних.
Важнейшая группа шаперонов - шаперонины . Интересна их структура: они представляют собой бочонки, составленные из двух колец. Сворачивающийся белок попадает внутрь шаперонина, а «вход» закрывается специальной «шапочкой» либо смыканием краев блоков, из которых состоят кольца , чтобы белковая молекула не покинула шаперонин раньше времени (рис. 7). В таком защищенном состоянии белок может окончательно принять нативную конформацию. Пока малопонятны процессы, происходящие внутри бочонков-шаперонинов.
Рисунок 7. Схематическое изображение двух типов шаперонинов - I и II. а - Шаперонины I типа характерны для бактерий (шаперон GroEL имеет структуру бочонка, составленного из двух колец, в каждом - 7 «блоков»; внутри шаперонина - камера, в которой происходит превращение расплавленной глобулы в нативную; бочонок закрывается «крышкой» - GroES ); б - Шаперонины II типа, характерные для архей и эукариот (здесь каждое из двух колец состоит из 8 «блоков»; закрытие камеры происходит не за счет присоединения «крышки», а по механизму объектива фотоаппарата ).
Нужно сказать, что шапероны не только участвуют в фолдинге созревающих цепей, но и помогают «сломанным» белковым структурам, которые возникли в клетке в результате определенных воздействий, вновь принять правильную конформацию. Наиболее типичная причина таких «поломок» - тепловой шок, то есть поднятие температуры. В связи с этим часто употребляют другие названия шаперонов - белки теплового шока (heat shock proteins, hsp ) или белки стресса. Шапероны выполняют другие важные функции в клетке, например, транспорт белков через мембраны и сборку олигомерных белков.
Заключение
Итак, для фолдинга белка строго необходимы следующие условия: первичная структура, конкретные физико-химические условия, а также две группы вспомогательных белков - специфически работающие ферменты и неспецифически работающие шапероны.
Резюмируя, скажем, что белковый фолдинг - одна из центральных проблем современной биофизики. И хотя накоплен большой арсенал данных об этом явлении, до сих пор оно малопонятно, что выражается, в конечном счете, в невозможности предсказания трехмерной структуры на основании аминокислотной последовательности (особенно это касается крупных, в том числе олигомерных, белков). Успехи в этой области, а особенно моделирования de novo
. (2005). Science.
309
, 78–102;