Принцип работы дифференциально диагностических сред. Дифференциально- диагностические среды

Применяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды микроорганизмов различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав ДДС входят:

1. Питательная основа, обеспечивающая размножение микроорганизмов

2. Определенный углевод - лактоза

3. Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге pH среды в кислотную сторону, вследствие ферментации соответствующего углевода.

ДДС активно применяются для дифференциации видов микроорганизмов семейства кишечных.

Элективные питательные среды

Предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологических особенностей, которые отличают микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации соли, холерного вибриона - в щелочной среде.

Разлив сред

1. Агаровых сред в чашки Петри:

а) расплавить на водяной бане, остудить до 45-50ºС с МПА

б) поставить чашку крышкой вверх

в) сосуд до средой взять в правую руку, держа его у огня

г) левой рукой вынуть пробку, зажав ее мизинцем и ладонью

д) обжечь горлышко бутылки со средой и двумя пальцами левой руки слегка приоткрыть крышку

е) ввести под нее горлышко бутыли, не касаясь им края чашки и налить 15-20 мл. среды.

Если посев проводят в день разлива среды, то её необходимо подсушить в термостате 20-30 минут в разобранном виде, открыто стороной вниз. Если посев проводят на следующий день, то чашки не подсушивая заворачивают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали и помещают в холодильник.

2. Агаровых среда в пробирки:

а) взять сосуд с расплавленной и остуженной до 45ºС средой

б) левой рукой взять пробирку

в) правой рукой извлечь пробку из пробирки, а левой рукой из сосуда со средой, зажав ее мизинцем и ладонью

г) обжечь края пробирки и сосуда со средой, внести в пробирку 3-5 мл среды

д) вновь обжечь горлышки емкостей, закрыть из пробками

Агаровые среды могут застывать в пробирках в виде:

1. Скошенного столбика

2. Комбинированного столбика

3. Столбика

Для получения скошенного и комбинированного столбика, пробирки с расплавленной агаровой массой укладывают в наклонном положении на специальную подставку, чтобы среда не заходила на 2/3 пробирки, не смачивала пробку. После застывания среды, пробирки ставят вертикально в штатив, дают стечь конденсату вниз. Пользоваться средой без конденсата нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Мясо-пептонный агар

Дифференциально-диагностические среды (например, среды Хисса, Кларка ) применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена , дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразоваиия, среды для определения протеолитической активности и комбинированные (политропные) среды. В такие среды также часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андраде, бромкрезоловый пурпурный и крезоловый красный), помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андраде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании реактив Андраде и индикатор бром-тимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разделяют на четыре основные группы.

Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты . Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда Минкевича ) и среды Хисса . Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).

Среды для определения редуцирующей способности . В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный, индигокармйн), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).

Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий . Наиболее известны нитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера .

В мясопептонный бульон добавляют 3-4% агара, доводят pH до 7,6, разливают в склянки по 100 мл и стерилизуют, как обычно, в автоклаве, сохраняя в таком виде до момента приготовления фуксинсульфитного агара. Готовят фуксинсульфитный агар в день использования. Заготовлять впрок и хранить эту среду нельзя, так как она быстро краснеет.

К 100 мл расплавленного и охлажденного до 70°С 3-4%-ного мясопептонного агара стерильно добавляют 1 г лактозы, предварительно растворив и прокипятив ее в 5 мл стерильной воды. Кроме того, сюда же добавляют 0,5 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2,5 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора сернистокислого натра. Сернистокислый натр (Na2SO3) в количестве 0,5 г растворяют в 5 мл воды и перед употреблением стерилизуют кипячением.

Можно поступить и несколько иначе. Фуксин и сульфит натрия сначала смешивают в пробирке: к 0,5 мл раствора фуксина прибавляют при встряхивании раствор сульфита натрия до тех пор, пока жидкость в пробирке не станет бесцветной или слегка розовой. И в расплавленный и несколько охлажденный агар вливают уже эту смесь. Колбу со средой тщательно встряхивают для перемешивания и среду разливают в чашки Петри. После застывания среды ее подсушивают в термостате при 37 °С в течение 30 мин.

В горячем состоянии среда должна быть слабо-розового цвета, а после остывания совершенно бесцветной. Обесцвечивание фуксина в среде Эндо вызывает введенный сернистокислый натр.

Среда Симмонса

При идентификации микробов группы коли (чтобы отличить почвенный вид Escherichia coli aёrogenes от фекального вида Escherichia coli commune) применяется цитратная среда Симмонса. В 1 л дистиллированной воды растворяют 1,5 г фосфорнокислого натра (или однозамещенного фосфорнокислого аммония), 1 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РO4), 0,2 г сернокислого магния, 2,5-3 г кристаллического лимоннокислого натрия, устанавливают pH 7,0-7,2, добавляют 2% агара и, расплавив среду, разливают ее в колбы по 100 мл. Стерилизуют в автоклаве 15 мин при 120°С.

Перед употреблением в среду необходимо добавить индикатор. Можно использовать либо бромтимолблау, либо фенолрот. Индикатор добавляют к 100 мл расплавленной среды. Бромтимолблау берут в количестве 1 мл спиртового 1,5%-ного раствора. Среда приобретает оливково-зеленый цвет. Фенолрот добавляется в количестве 2 мл 1,5%-ного спиртового раствора. Среда окрашивается в желтый цвет. После добавления индикатора среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 мин.

Пестрый ряд углеводов, или среды Гисса

Для определения ферментативной способности микроорганизмов пользуются средами Гисса. В зависимости от наличия в микробной клетке того или иного фермента она способна разлагать какой-либо один из углеводов с образованием определенных продуктов разложения, поэтому в состав среды вводится какой-либо углевод: лактоза, глюкоза, маннит, сахароза и пр. Набор таких сред получил название «пестрого ряда углеводов».

Сначала готовят пептонную воду: на 1 л дистиллированной воды берут 10 г пептона и 5 г химически чистой поваренной соли, кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный фильтр (фильтрат должен быть совершенно прозрачным) и устанавливают pH 7,2-7,4. Затем к 100 мл пептонной воды добавляют по 0,5 г одного из применяемых углеводов и по 1 мл индикатора Андреде.

В состав индикатора Андреде входит: 0,5 г кислого фуксина, 16 мл 1 н. раствора едкого натра (NaOH) и 100 мл дистиллированной воды. При необходимости индикатор можно готовить заранее и сохранять его в темном месте, предварительно про-кипятив при 100 °С в течение 15 мин. После введения индикатора среды разливают по пробиркам с поплавками и стерилизуют в кипятильнике Коха трижды по 30 мин. По окончании стерилизации поплавки должны быть погружены в среду, в противном случае пробирка не может быть использована. Среды Гисса с реактивом Андреде имеют соломенно-желтый цвет без розового оттенка. При развитии в среде микроорганизмов последние, разлагая сахар с образованием кислоты, вызывают изменение реакции. А так как в кислой среде индикатор Андреде краснеет, то это и является свидетельством, что микроорганизм использует данный сахар для своей жизнедеятельности. Отсутствие покраснения, наоборот, свидетельствует об отсутствии в ферментативном комплексе изучаемого микроба фермента, разлагающего имеющийся в среде углевод.

1.1. Среды Эндо, Левина, Плоскирева . Используют как дифференциально-диагностические элективные среды для культивирования бактерий кишечной группы (содержит лактозу). Микроорганизмы, ферментирующие находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - лактозоположительные (колонии красного цвета с металлическим блеском или без блеска). Колонии микробов, не ферментирующие лактозу, бесцветные - лактозонегативные – нежно-розовые, прозрачные, пропускающие свет.

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

1.2. Среды с крахмалом используют для выявления микроорганизмов, образующих амилазу. Наличие фермента определяется при добавлении к культуре несколько капель раствора Люголя

(цвет среды не изменяется). Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

1.3. Молоко. При росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

2. Коммерческие наборы – для изучения биохимических свойств (идентификации микроорганизмов по сахаролитической и протеолитической активности).

2.1. Среды Гисса с углеводами (глюкоза, лактоза, сахароза, арабиноза и другие) в которых выявляют ферментативную активности микроорганизмов.Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Соломенно-желтого цвета среда при положительной реакции меняет цвет на красный или интенсивно розовый, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее цвета. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах.

Состав: пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде (фуксин)- 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

2.2. Среды для изучения протеолитических свойств

Среды с желатином . В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитические ферменты выявля­ются путем разжижения желатины.

Среды с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки.

Среды с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты.

2.3. Микротесты - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды.

2.4. Системы индикаторные бумажные (СИБ) - дифференциально-диагностические среды на фильтровальной бумаге.

Для культивирования и дифференциации анаэробных микроорганизмов: среда Вильсон-Блера . Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na 2 S0 3 , хлорид железо FeCl 2 . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара. При этом осуществляется восстановление Na 2 S0 3 в Na 2 S (сульфит натрия), который соединяясь с хлоридом железа, образует сульфат железа черного цвета. Разрыв питательной среды связан с газообразованием.

к работе № 2

Микроорганизмам, как всему живому, присущи три основные физиологические функции: питание, дыхание и размножение.

Основные понятия темы:

Колония – видимое невооруженным взглядом скопление микробов на плотной питательной среде, выросшее из одной клетки.

Колония - это потомство микробов, выросших из одной клетки. Т.к. все микробы в колонии выросли из одной клетки, они относятся к одному виду, т.е. в каждой изолированной колонии (отдельно стоящей, не сливающейся с другими колониями) содержится чистая культура.

Чистая культура – популяция микроорганизмов, состоящая из особей одного вида.

Индикация – обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода)

Идентификация – определение вида, типа, биовара, серовара, фаговара выделенной чистой культуры.

к работе № 3

Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением необходимой для метаболизма энергии. По типу дыхания микроорганизмы делятся на 3 основные группы: аэробы могут жить только в присутствии кислорода (холерный вибрион); факультативные анаэробы могут жить при любом процентном содержании кислорода и без него (кишечная палочка); анаэробы (облигатные) – только в отсутствие кислорода (возбудители газовой гангрены). При культивировании облигатных анаэробов требуется создание особых условий анаэробиоза . При этом используют особые приборы и среды (анаэростат, эксикатор, среды тиогликолиевая, Вильсона-Блера).