На графике приведена зависимость скорости ферментативной реакции. Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации субстратов, ферментов, температуры
Ферментативная кинетика изучает скорость реакций, катализируемых ферментами в зависимости от различных условий (концентрации, температуры, pH и др.) их взаимодействия с субстратом.
Однако ферменты - это белки, чувствительные к влиянию различных внешних воздействий. Поэтому при изучении скорости ферментативных реакций учитывают, главным образом, концентрации реагирующих веществ, а влияние температуры, pH среды, активаторов, ингибиторов и прочих факторов стараются свести к минимуму и создают стандартные условия. Во-первых, это оптимальное для данного фермента значение pH среды. Во-вторых, рекомендуется придерживаться температуры 25°С, в тех случаях, где это возможно. В-третьих, достигают полного насыщения фермента субстратом. Этот момент особенно важен, поскольку при низкой концентрации субстрата не все молекулы фермента участуют в реакции (рис. 6.5, а ), значит и результат будет далек от максимально возможного. Наибольшая мощность катализируемой реакции, при прочих равных условиях, достигается, если каждая молекула фермента участвует в превращении, т.е. при высокой концентрации фермент-субстратного комплекса (рис. 6.5, в). Если же концентрация субстрата не обеспечивает полного насыщения фермента (рис. 6.5, б ), то скорость протекающей реакции не достигает максимального значения.
Рис. 65.
а - при низкой концентрации субстрата; 6 - при недостаточной концентрации субстрата; в - при полном насыщении фермента субстратом
Скорость ферментативной реакции, измеренной при соблюдении перечисленных условий, и полном насыщении фермента субстратом называют максимальной скоростью ферментативной реакции (V).
Скорость ферментативной реакции, определяемая при неполном насыщении фермента субстратом, обозначается v.
Ферментативный катализ упрощенно можно описать схемой
где F - фермент; S - субстрат; FS - фермент-субстратный комплекс.
Каждая стадия этого процесса характеризуется определенной скоростью. Единицей измерения скорости ферментативной реакции служит количество молей субстрата, превращаемое в единицу времени (как и скорость обычной реакции).
Взаимодействие фермента с субстратом приводит к образованию фермент-субстратного комплекса, но этот процесс обратимый. Скорости прямой и обратной реакций зависят от концентраций реагирующих веществ и описываются соответствующими уравнениями:
В состоянии равновесия справедливо уравнение (6.3), поскольку скорости прямой и обратной реакции равны.
Подставив значения скорости прямой (6.1) и обратной (6.2) реакции в уравнение (6.3), получим равенство:
Состояние равновесия характеризуется соответствующей константой равновесия К р, равной отношению констант прямой и обратной реакций (6.5). Величина, обратная константе равновесия, называется субстратной константой K s , или константой диссоциации фермент-субстратного комплекса:
Из уравнения (6.6) ясно, что субстратная константа уменьшается при высокой концентрации фермент-субстратного комплекса, т.е. при большой его устойчивости. Следовательно, субстратная константа характеризует сродство фермента и субстрата и соотношение констант скоростей образования и диссоциации фермент-субстратного комплекса.
Явление насыщения фермента субстратом изучали Леонор Михаэлис и Мод Мептен. На основе математической обработки результатов ими было выведено уравнение (6.7), получившее их имена, из которого ясно, что при высокой концентрации субстрата и низком значении субстратной константы скорость ферментативной реакции стремится к максимальной. Однако это уравнение носит ограниченный характер, поскольку учитывает не все параметры:
Фермент-субстратный комплекс в процессе реакции может подвергаться превращениям в разных направлениях:
- диссоциировать на исходные вещества;
- превращаться в продукт, от которого отделяется фермент в неизменном виде.
Поэтому для описания суммарного действия ферментативного процесса введено понятие константы Михаэлиса К т, которая выражает взаимосвязь констант скоростей всех трех реакций ферментативного катализа (6.8). Если оба слагаемых разделить на константу скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса, то получится выражение (6.9):
Из уравнения (6.9) вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше субстратной константы на величину k 2 /k v
Численно К т равна такой концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимально возможной скорости и соответствует такому насыщению фермента субстратом, как на рис. 6.5, б. Поскольку на практике не всегда удается достичь полного насыщения фермента субстратом, то именно К т используется для сравнительной характеристики кинетических характеристик ферментов.
Скорость ферментативной реакции при неполном насыщении фермента субстратом (6.10) зависит от концентрации фермент-субстратного комплекса. Коэффициентом пропорциональности служит константа реакции освобождения фермента и продукта, поскольку при этом меняется концентрация фермент-субстратного комплекса:
После преобразований, с учетом представленных выше зависимостей, скорость ферментативной реакции при неполном насыщении фермента субстратом описывается уравнением (6.11), т.е. зависит от концентраций фермента, субстрата и их сродства K s:
Графическая зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата не является линейной. Как очевидно из рис. 6.6, с увеличением концентрации субстрата наблюдается рост активности фермента. Однако при достижении максимального насыщения фермента субстратом скорость ферментативной реакции становится максимальной. Следовательно, фактором, ограничивающим скорость реакции, является образование фермент-субстратного комплекса.
Практика показала, что концентрации субстратов, как правило, выражаются значениями намного меньше единицы (10 6 -10 3 моль). Оперировать такими величинами в расчетах довольно сложно. Поэтому Г. Лайнуивер и Д. Берк предложили выражать графическую зависимость скорости ферментативной реакции не в прямых координатах, а в обратных. Они исходили из предположения, что для равных величин равны и обратные им значения:
Рис. 6.6.
После преобразования выражения (6.13) получается выражение, называемое уравнением Лайнуивера - Бэрка (6.14):
Графическая зависимость уравнения Лайнуивера- Берка носит линейный характер (рис. 6.7). Кинетические характеристики фермента определяются следующим образом:
- отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 1/V;
- отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, равен -1 /К т.
Рис. 6.7.
Считается, что метод Лайнуивера - Берка позволяет более точно, чем в прямых координатах, определить максимальную скорость реакции. Из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирования фермента.
Существуют и другие способы преобразования уравнения Михаэлиса- Ментен. Графические зависимости используют при изучении влияния различных внешних воздействий на ферментативный процесс.
Скорость ферментативных реакций зависит от концентрации суб-
страта. Эта зависимость носит сложный характер, который для определенных ферментов описывается параболической кривой (рис. 29).
Рисунок 29 – Зависимость скорости ферментативной реакции
от концентрации субстрата
Параболический характер зависимости объясняется тем, что при взаимодействии фермента с субстратом происходит образование фермент-субстратного комплекса. Первоначально при увеличении концентрации субстрата происходит возрастание концентрации фермент-субстратных комплексов в реакционной смеси, что проявляется в параллельном повышении скорости реакции. При определенной концентрации субстрата (насыщающей) возникает своеобразное “насышение” всех активных центров молекул ферментов в реакционной смеси. Скорость ферментативной реакции при насыщающей концентрации становится максимальной. При дальнейшем повышении содержания субстрата в реакционной смеси она не изменяется.
Из графика зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата вычисляются два важных показателя:
1. Максимальная скорость реакции (V max). Она определяется как скорость реакции при насыщающей концентрации субстрата. Величина макси-мальной скорости отражает каталитическую мощность фермента. Ферменты, обладающие большей величиной V max , являются более мощными катализаторами. В единицу времени они катализируют превращение большего количества молекул субстрата. Величина максимальной скорос-ти выражается числом оборотов фермента. Число оборотов оценивается количеством молекул субстрата, превращаемых ферментом в единицу времени (с -1). Для большинства ферментов число оборотов находится в пределах 10 4 . В тоже время существуют ферменты, для которых число оборотов значительно больше (600000 – для карбангидразы) или меньше этой величины (100 – для химотрипсина).
2. Константа Михаэлиса (К м). Константа Михаэлиса представляет собой концентрацию субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной. Величина К м отражает сродство фермента к суб-страту. Чем больше эта величина, тем меньшее сродство к субстрату имеет фермент. К м выражается в молях субстрата. Так, величина К м по отношению к глюкозе у фермента глюкокиназы составляет 10 ммоль, а для гексокиназы – 0,01 ммоль. Гексокиназа проявляет большее сродство к глюкозе, чем глюкокиназа, при одинаковой концентрации субстрата она с большей скоростью катализирует фосфорилирование глюкозы.
На основании математического анализа кривой зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата Л. Михаэлисом и М. Ментен (1913) была выведена формула, позволяющая оценить взаимоотношение между скоростью реакции, максимальной скоростью и константой Михаэлиса. В настоящее время она определяется как уравнение Михаэлиса – Ментен.
V o = V max [S ]/K м + [S ],
где V o – скорость реакции, S – концентрация субстрата.
Общие свойства ферментов
Несмотря на существование определенных различий в строении, функции и внутриклеточной локализации, для ферментов характерен целый ряд общих свойств. К таковым относятся зависимость проявления их каталитической активности от температуры (термолабильность) и рН среды, а также субстратная специфичность.
Характерным свойством ферментов является термолабильность . Это явление может быть проиллюстрировано графиком зависимости скорости ферментативной реакции от температуры реакционной смеси (рис. 30).
Рисунок 30 – Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры
реакционной среды (t опт – оптимальная температура; V – скорость реакции)
Как видно из представленного графика при температуре, близкой к 4 о С ферментативные реакции практически не идут. По этой причине биологические объекты могут определенное время храниться перед проведением биохимических исследований на холоде. Именно холод позволяет сохранять пищевые продукты от аутолиза (самопереваривания).
Повышение температуры сопровождается повышением скорости ферментативной реакции. Причиной этого является повышение кинетичес-кой энергии молекул субстрата и фермента, способствующее повышению скорости взаимодействия между ними. Подобное явление наблюдается до температуры, которая соответствует температурному оптимуму фермента. Температурный оптимум фермента соответствует той температуре, при которой скорость ферментативной реакции максимальна. Для ферментов теплокровных животных оно обычно составляет 28 о С или 37 о С.
Дальнейшее повышение температуры реакционной смеси приводит к постепенному понижению скорости ферментативной реакции. Это явление обусловлено процессом термоденатурации полипептидной цепи белка. Денатурация сопровождается изменением структуры активного центра фермента, следствием чего и становится понижение сродства фермента к суб-страту. При температуре выше 55 о С большинство ферментов полностью утрачивает каталитические свойства (инактивируется). В этой связи прогревание до 55–56 о С широко используется для процедуры пастеризации, которая повышает срок хранения пищевых продуктов (молока и др.).
Большое влияние на скорость ферментативной реакции оказывает рН среды. Как видно из представленного на рис. 31 графика, он напоминает по форме график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры.
Рисунок 31 – Зависимость скорости (V ) ферментативной реакции
от рН среды (рН опт – рН оптимум фермента)
Резкое снижение скорости ферментативной реакции при экстремальных значениях рН связано с явлением денатурации полипептидной цепи белковой молекулы под действием кислот и щелочей. Фермент проявляет максимальную каталитическую мощность при величине рН, которая определяется термином рН-оптимум фермента. Большинство известных ферментов имеет оптимум рН в области от 5,0 до 7,5. Вместе с тем существует немало примеров ферментов, у которых величина рН-оптимума смещена в область кислых или щелочных значений рН. К таким ферментам относятся:
Причина существования зависимости скорости ферментативных реакций от рН связана с тем, что величина рН среды оказывает выраженное влияние на степень ионизации функциональных групп субстрата. Особенности ионизации молекулы янтарной кислоты при различной кислотности среды (рН):
Одновременно рН среды оказывает влияние и на степень ионизации аминокислотных радикалов, входящих в состав активного центра фермента:
Если образование фермент-субстратного комплекса стабилизируется за счет электростатических взаимодействий, то становится понятной роль рН в обеспечении оптимальных условий для течения ферментативной реакции (рис. 24).
Скорость реакций катализируемых ферментами, во взаимодействии которых с субстратами не имеют существенного значения электростали-ческие взаимодействия, в меньшей мере зависит от рН среды. На рис. 32 представлена зависимость скорости гидролиза белков папаином. Во взаимодействии этого фермента с субстратом основное значение приобретают гидрофобные взаимодействия. Как видно из представленного графика, у папаина вообще отсутствует четко выраженный рН-оптимум.
Рисунок 32 – Влияние рН на скорость гидролиза белка папаином.
Ферменты обладают определенной специфичностью в отношении субстратов. Под специфичностью подразумевается свойство ферментов катализировать превращение одного или группы сходных по строению субстратов. Существует несколько видов специфичности ферментов.
· Абсолютная специфичность. Под ней подразумевается способность фермента катализировать превращение только одного субстрата. К ферментам, обладающим абсолютной специфичностью, относятся аргиназа, уриказа рестриктазы и др.
· Относительная специфичность . Под ней подразумевается способность фермента катализировать превращение группы сходных по строению субстратов (т.н. протеолитические ферменты гидролизуют различные белки, липаза сложные эфиры глицерина и высших жирных кис-лот, гексокиназа фосфорилирует разные моносахариды). При этом специфичность определяется тем, что фермент оказывает влияние только на определенный тип связи (протеолитические ферменты гидролизуют пептидную связь, липаза гидролизует сложную эфирную связь и т.д.).
· Стереоспецифичность. Под этим термином подразумевается свойство фермента катализировать превращение одного стереоизомера субстрата. Так, ферменты, участвующие в превращении моносахаридов, проявляют специфичность по отношению к их D -стереоизомерам, а ферменты, участвующие в превращении аминокислот, – к их L -стерео-изомерам.
Активность ферментов
Особенностью ферментов как катализаторов является то, что они под действием разных внешних факторов способны изменять свои каталитические свойства. Мерой проявления силы каталитического действия ферментов является их активность . Способность ферментов менять свою активность в различных условиях имеет большой биологический смысл. Это свойство позволяет живой клетке приспосабливать состояние обменных процессов под сиюминутные потребности клеток, которые могут существенно изменяться под влиянием различных внешний факторов.
Определение активности ферментов играет важную роль их характеристике. Существуют некоторые общие принципы количественного определения активности ферментов. Активность ферментов можно определять так:
· либо по скорости накопления в реакционной смеси, где находится фермент продукта реакции;
· либо по скорости исчезновения из реакционной смеси субстрата ферментативной реакции.
Оба эти подхода равнозначны и могут быть использованы на практике. Однако при определении активности фермента необходимо соблюдать следующие условия: в реакционной смеси, в которой проводится определение активности фермента,
· температура должна соответствовать температурному оптимуму данного фермента;
· рН среды должна соответствовать рН-оптимуму данного фермента;
· концентрация субстрата должна быть не меньше насыщающей;
· должны присутствовать кофакторы, если таковые у этого фермента существуют;
· должны присутствовать активаторы фермента.
Таким образом, активность фермента определяется в оптимальных для него условиях. В этих условиях активность фермента пропорциональна его содержанию в исследуемом образце и поэтому может использоваться для косвенной оценки его концентрации.
Активность фермента количественно выражается в единицах активности . За одну единицу активности фермента (ЕД) принимается активность фермента, при которой под его влиянием происходит образование 1 мкмоль продукта реакции (или исчезновение 1 мкмоль суб-страта) в минуту . В системе СИ за единицу ферментативной активности принят катал (кат). 1 катал соответствует активности фермента, при которой происходит образование одного моля продукта реакции (исчезновение одного моля субстрата) за секунду.
Для характеристики ферментов используют также величину удельной активности. Эта единица отражает активность фермента в расчете на единицу его массы и выражается в мкмоль/мин мг белка. Единицы удельной активности используют для оценки чистоты ферментных препаратов. Чем выше величина удельной активности, тем чище ферментный препарат.
§ 12. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Кинетика ферментативных реакций – наука о скоростях ферментативных реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость ферментативной реакции определяется химическим количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:
где v – скорость ферментативной реакции, – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время.
Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции. Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента. Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.
В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:
Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.
Интересно знать! Ферменты используются в медицине для диагностики различных заболеваний. При инфаркте миокарда вследствие повреждения и распада сердечной мышцы в крови резко возрастает содержание ферментов аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы. Выявление их активности позволяет диагностировать данное заболевание.
Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции
Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.). При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (V max). При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.
Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата
График зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,
где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; K M – константа Михаэлиса.
Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ V max , получаем K M = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.
Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.
Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента
Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 32.
Рис. 32. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
При низких температурах (приблизительно до 40 – 50 о С) повышение температуры на каждые 10 о С в соответствии с правилом Вант-Гоффа сопровождается увеличением скорости химической реакции в 2 – 4 раза. При высоких температурах более 55 – 60 о С активность фермента резко снижается из-за его тепловой денатурации, и, как следствие этого, наблюдается резкое снижение скорости ферментативной реакции. Максимальная активность ферментов наблюдается обычно в пределах 40 – 60 о С. Температура, при которой активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом. Температурный оптимум ферментов термофильных микроорганизмов находится в области более высоких температур.
Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.
Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.
Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:
a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,
b) ионизацию субстрата,
c) конформацию фермента и его активного центра.
Ингибирование ферментов
Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами . Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие – используются в качестве лекарственных препаратов.
Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые . Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением активности фермента невозможна:
Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего. Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия. На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов - веществ, ядовитых для насекомых.
Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:
Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.
Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту. При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо. После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.). Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре, такое ингибирование называется конкурентным.
Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.
Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов. Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.
Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).
Рис. 35. Механизм действия неконкурентного ингибитора
В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN - . Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.
Аллостерические ферменты
Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo – другой, stereo – участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36). С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами . Эффекторы бывают положительными – активирующими фермент, и отрицательными – ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента. Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.
Рис. 36. Структура аллостерического фермента.
Регуляция мультиферментных систем
Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:
В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.
Кинетика ферментативных реакций. Этот раздел энзимологии изучает влияние хими ческих и физических факторов на скорость ферментативной реакции. В 1913 г. Михаэлис и Ментен создали теорию ферментативной кинетики, исходя из того, что фермент (Е) вступает во взаимодействие с субстратом (S) с образованием промежуточного ферментсубстратного комплекса (ЕS), который далее распадается на фермент и продукт реакции по уравнению:
Каждый этап взаимодействия субстрата с ферментом характеризуется своими константами скорости. Отношение суммы констант скорости распада ферментсубстратного комплекса к константе скорости образования ферментсубстратного комплекса называется константой Михаелиса (Кm). Она определят сродство фермента к субстрату. Чем ниже константа Михаелиса, тем выше сродство фермента к субстрату, тем выше скорость ка тализируемой им реакции. По величине Кm каталитические реакции можно поделить на быстрые (Кm 106 моль/л и меньше) и медленные (Кm 102 до 106).
Скорость ферментативной реакции зависит температуры, реакции среды, концентрации реагирующих веществ, количества фермента и других факторов.
1. Рассмотрим зависимость скорости реакции от количест ва фермента. При условии избытка субстрата скорость реакции пропорциональна количеству фермента, но при избыточном количестве фермента прирост скорости реакции будет сни жаться, поскольку уже не будет хватать субстрата.
2. Скорость химических реакций пропорциональна концентрации реагирующих ве ществ (закон действующих масс). Этот закон применим и для ферментативных реакций, но с определенными ограничениями. При постоян
ных количествах фермента скорость реакции действительно пропорциональна концентрации субстрата, но, только в области низких концен траций. При высоких концентрациях субстрата наступает насыщение фермента субстратом, то есть наступает такой момент, когда уже все мо лекулы фермента задействованы в каталитическом процессе и прироста скорости реакции не будет. Скорость реакции выходит на макси мальный уровень (Vmax) и дальше уже не зависит от концентрации субстрата. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата следует определять в той части кривой, кото рая ниже Vmax. Технически легче определить не максимальную скорость, а ½ Vmax. Этот параметр является главной характеристикой ферментативной реакции и дает возможность определить константу Михаелиса (Кm).
Кm (константа Михаэлиса) – это такая концентрация субстрата, при которой ско рость ферментативной реакции равна по ловине максимальной. Отсюда выводится уравнение Михаэлиса–Ментена скорости ферментативной реакции.
А). Зависимость скорости ферментативной реакции от количества ферментов
При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость реакции будет зависеть от концентрации фермента. Графическая зависимость такой реакции имеет вид прямой линии.Однако количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента: одна международная единица активности (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Оптимальные условия индивидуальны для каждого фермента и зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов.
Зависимость накопления продукта (А) и убыли субстрата (Б) от времени (продолжительности) протекания реакции . Скорость ферментативной реакции определяется изменением концентрации продукта или субстрата за единицу времени. В реакциях, катализируемых ферментами 1 и 2, начальная скорость реакции, катализируемой ферментом 1, ниже, чем скорость реакции, катализируемой ферментом 2, так как тангенс угла наклона касательной к кривой профиля реакции, проведённой из "О" точки у второго фермента выше, как в случае накопления продукта (А), так и убыли субстрата (Б). Скорость в любой момент времени t определяется тангенсом угла наклона касательной к профилю реакции в момент времени t. Период времени ферментативной реакции характеризуется линейным накоплением продукта (или убылью субстрата) в зависимости от длительности реакции. Период ферментативной реакции характеризуется нелинейным накоплением продукта (или убылью субстрата) в зависимости от времени реакции.
Количество единиц активности nME определяют по формуле:
Б). Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры среды
Повышение температуры до определённых пределов оказывает влияние на скорость ферментативной
реакции подобно влиянию температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Кроме того, температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции. Однако скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности, возникающим из-за термической денатурации белковой молекулы
Для большинства ферментов человека оптимальна температура 37-38 °С. Однако в природе существуют и термостабильные ферменты. Например, Taq-полимераза, выделенная из микроорганизмов, живущих в горячих источниках, не инактивируется при повышении температуры до 95 °С. Этот фермент используют в научно-практической медицине для молекулярной диагностики заболеваний с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В). Зависимость скорости ферментативной реакции от количества субстрата
При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции Vmax.
Таким образом, концентрация фермента - лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л. Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г.
Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.
Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = .
Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением (математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях по ферментативной кинетике):
V = Vmax[S] / Km + [S]
Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен.
Уравнение Михаэлиса-Ментен - основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Если концентрация субстрата значительно больше Km (S >> Km), to увеличение концентрации субстрата на величину Кm практически не влияет на сумму (Km + S) и её можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = Vmax. В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что Vmax - величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от концентрации субстрата.
Если концентрация субстрата значительно меньше Km(S << Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).
Vmах и Km - кинетические характеристики эффективности фермента.
Vmax дает характеристику каталитической активности фермента и имеет размерность скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента и в условиях избытка субстрата. Кm характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше Кm, тем больше сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции и наоборот, чем больше Кm, тем меньше начальная скорость реакции, тем меньше сродство фермента к субстрату.