9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

морфология и тинкториальные свойства

культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)

серологические свойства (антигенные)

вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

патогенность для животных

фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

чувствительность к антибиотикам

другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

Бактериологический (культуральный) метод

совокупность методик искусственного культивирования микроорганизмов на питательных средах в целях их идентификации при установлении д-за инфекционного заболевания или иного вызванного микробами процесса и определения ряда физиологических св-в к-ры с др. целями, напр., при выборе химиотерапевтического препарата. Современные методы изучения большинства биол. св-в бактерий возможны только при наличии чистой к-ры (см.). Контаминация к-ры др. видом микробов, как правило, ведет к искажению результатов и неправильному заключению. Поэтому первой задачей Б.м. является получение чистой к-ры какого-либо вида (вара) из микробной ассоциации и предупреждение контаминации посторонней микрофлорой материала для исследования и микробной к-ры на всех этапах исследования. Это возможно при заборе материала в стерильных условиях в стерильную посуду, посеве материала в стерильные среды стерильным инструментом, предупреждении попадания микробов из воздуха в процессе доставки, хранения и инкубации материала и засеянных питательных сред. Вторая задача Б.м. - идентификация микробов (см.) выделенной чистой к-ры, третья - определение дополнительных св-в, напр., чувствительности к антибиотикам, вирулентности. Этапы Б.м.: 1) забор материала (см. Материалы для исследования) и его доставка в бактериол. лабораторию; 2) микроскопия иссл. материала (см. Бактериоскопический метод). Этот этап часто не выполняется, хотя, несмотря на меньшую чувствительность, предварительная микроскопия в ряде случаев дает ориентировочные сведения о возбудителе и позволяет выбрать необходимые для посева среды; 3) обработка иссл. материала физ. или хим. факторами в целях удаления или уменьшения посторонней микрофлоры. Эта мера применяется, напр., при исследовании мокроты, выделении кислотоустойчивых и спорообразующих микробов; 4) посев иссл. материала (см. Посевы бактериологические) на питательные среды для получения изолированных колоний; 5) инкубация засеянных питательных сред. Сроки и температура инкубации зависят от предполагаемой видовой принадлежности к-ры. Обычно посевы выдерживают в термостате при 37°С 1-2 дня. Если рост отсутствует, срок инкубации может быть продлен еще на 2 - 3 дня. При более длительной инкубации необходимо предупредить высыхание среды, для чего посевы помещают в эксикатор с водой или пробки пробирок заливают парафином; 6) исследование колоний (см.). Для изучения выбирают однородные изолированные колонии, располагающиеся далеко от краев чашки и по штриху петли, окружают их чертой, нумеруют. Если исследование ведется ненаправленно (полиэтиологичный процесс и пр.), то на основании результатов визуального осмотра выбирают по 2 - 3 колонии всех имеющихся на чашке типов и делают с них мазки; 7) пересев с выбранных колоний на среды накопления. Для этого с остатка колонии, в мазке к-рой выявлены однородные по форме и окраске бактерии, петлей, стараясь не задеть соседние колонии, забирают часть к-ры и засевают на скошенный в пробирке МПА или специальную среду штрихом; 8) инкубация посевов в термостате до появления сплошного роста (обычно 1 -2 дня); 9) определение чистоты выросшей на скошенных средах к-ры путем макроскопического осмотра роста и микроскопии мазка из него; 10) идентификация выделенной чистой к-ры и в случае необходимости (по требованию клинициста, эпидемиолога) определение различных биол. св-в; 11) заключение о видовой принадлежности выделенной к-ры и ее св-вах. Заключение дается на официальном бланке со ссылкой на номер, под крым эта к-ра занесена в лабораторный журнал. Б.м. является основным в д-ке большинства бактер. инфекций. Он, как правило, обладает высокой чувствительностью, позволяющей выделить из, иссл. материала чистую к-ру, даже если в посевной дозе материала содержалось несколько десятков особей. Для Б.м. характерна высокая специфичность. Выделение того или иного вида бактерий из патологического материала при соблюдении ряда условий (см. Возбудитель болезни) надежно устанавливает этиологию патологического процесса. Исключение составляют условно-патогенные аутохтонные для того или иного биотопа бактерии, для определения этиол. роли к-рых нужны специальные критерии, а также разграничение носительства и заболевания (напр., дифтерийное носительство при стрептококковой ангине). Ценность Б.м. состоит также в том, что с его помощью могут быть установлены св-ва к-ры, необходимые для назначения химио- и серотерапии, выявления источника инфекции и механизмов передачи возбудителя, выбора противоэпидемических мероприятий. Наконец, Б.м. относится к ранним методам д-ки. Недостатки Б. м. - опасность инфицирования, сложность, трудоемкость, длительность. Достоверные данные о составе микрофлоры и ее св-вах можно получить только при исследовании выборки из 3 -10 к-р.

9971 0

Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.

В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.

К основным требованиям , предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:

• взятие материала до начала этиотропного лечения;
• соблюдение условий стерильности при сборе материала;
• техническую правильность сбора материала;
• достаточное количество материала;
• обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
• сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.

Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.

Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3-4 пробы крови, взятые с интервалом 4-6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры, если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.

Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1-2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1-2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.

Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.

Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5-6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае - в транспортную среду.

Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.

Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.

Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами - лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).

Мокрота . Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.

Промывные воды бронхов . При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.

Отделяемое глотки, ротовой полости и носа . Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.

Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.

Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.

Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют , т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.

Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.

Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.

Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред , а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

Культуральныйметод исследования представляет собой выделение из питательной средыбактерий определённого вида путём культивирования,с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. Для проведения бактериологической диагностики используются схемы, которые утверждены Минздравом.

Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой . После окончательной идентификации их характеристик, бактерии,выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.

Цель метода :

1. Этиологический диагноз, то есть выделение и идентификация чистой культуры бактерий.

2. Определение количества микроорганизмов и их особых характеристик. Например, специфическая реакция на антибиотики.

3. Выявление внутриродовых отличий микроорганизмов, на основе их эпидемиологической и генетической составляющей. Это необходимо для определения общности микроорганизмов выделенных в разных местах и разных условиях, что важно для эпидемиологических целей.

Данный метод исследования имеет определённый ряд этапов, различных для аэробных, факультативных и облигатных аэробных бактерий.

Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.

1 этап

А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение итранспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости отсвойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.

В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.

Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.

2 этап

А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности.Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре(для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).

Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера.Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:

· МПА

· 0,1% глюкозы

· 1% лактозы

· Специальный реактив на сероводород

· Феноловыйкрасный индикатор.

3 этап

А) Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.

Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).

В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.

Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.

Рис. Питательная среда Клиглера:

1 – исходная среда,

2 – рост E. coli,

3 – рост S. paratyphi B,

4 – рост S. Typhi.

E . coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.

S. paratyphi – способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.
S. paratyphi A- не продуцирует сероводород.
S. paratyphi B – сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).

S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.

Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.

Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.

В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.

Бактериологический метод исследования. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (1-2 этапы)

1. Суть бактериологического метода

3. Методы получения изолированных колоний

4. Методы получения чистой культуры

1. Провести первичный посев методом Коха и Дригальского

2. Выделить чистую культуру

План работы:

1. Бактериологический метод исследования

2. Этапы бактериологического метода

3. Понятие: чистая культура, штамм, колония

4. Методы получения изолированных колоний

5. Методы получения чистой культуры аэробных бактерий

Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей).

Бактериологический метод позволяет определить:

1. Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания

2. Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение

3. Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции

Первый этап - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды).

Второй этап - характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды.

Третий этап - идентификация чистой культуры - определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров.

Культура микроорганизмов - это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура - это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку:

1. Морфовары - отличаются по морфологии

2. Хемовары - отличаются по биохимическим свойствам

3. Серовары - отличаются по антигенным свойствам

4. Фаговары - отличаются по чувствительности к фагам

Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм - это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония - видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.

Первый этап исследования - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева.

Существует два метода получения изолированных колоний:

1. Метод Дригальского