Методика контрастирования (окраски) парафиновых срезов Гематоксилином и эозином (г.-э)

1) Парафиновые срезы, наклеенные на предметные стёкла, освобождают от парафина (депарафинизируют) поочерёдно погружая их в 2 Порции ксилола (толуола, бензола) – По 3 мин.

2) Производят гидратацию срезов путём поэтапного помещения их в спирты убывающей концентрации (96º, 80º, 60º, 40º, а затем в дистиллированную воду На 3-4 мин .

3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (основного) красителя - гематоксилина – В течение 2 мин.

4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затеи всполаскивают в дистиллированной воде.

5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - Эозина – в течение 0,5-1 мин.

6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.

7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их помещают в Спирты возрастающей концентрации – поочерёдно в спирты 40º, 60º, 80º, 96º, и 100º – По 1-2 мин.

8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем - в двух порциях ксилола – по 2 мин .

9) Заключение срезов: на срез стеклянной палочкой наносят маленькую каплю раствора канадского бальзама (полистирола, дамар-лака и др.) и накрывают обезжиренным покровным стеклом, осторожно опуская его под углом, стремясь избежать попадания пузырьков воздуха. Сверху можно поместить небольшой грузик для удаления избытка бальзама (полистирола).

Оценка результатов окрашивания

Гематоксилин является щелочным (основным) красителем. Он окрашивает структуры клеток и тканей, имеющие кислую среду, например, ДНК и РНК в ядрах клеток, кислые гликозаминогликаны в межклеточном веществе соединительной ткани. Поэтому такие структуры называются Базофильными (от лат. Basis – основание). В окрашенном гематоксилином микропрепарате ядра клеток будут тёмно-синими или тёмно-фиолетовыми.

Эозин (от греч. заря) имеет красный или розовый цвет и является кислым красителем. Поэтому окрашивающиеся им щелочные компоненты клеток или неклеточных структур называются Оксифильными, Или ацидофильными (от греч. Oxy Или лат. Acidum – кислота), Или эозинофильными .

Следует учесть, что цитоплазма разных клеток может окрашиваться как базофильно, так и эозинофильно. Например, клетки, активно синтезирующие белковые компоненты, содержат в цитоплазме большое количество рибосом (а, следовательно, и РНК), поэтому их цитоплазма окрашивается Базофильно . Если структуры цитоплазмы окрашиваются одновременно и основными, и кислыми красителями, то они называются Нейтрофильными , или Гетерофильными .

Есть целый ряд красителей, например тиазинового ряда (азур, толуидиновый синий, метиленовый синий и др.), которые при взаимодействии с компонентами клеток и тканей изменяют свой цвет на им несвойственный (синий на красный или фиолетовый; чёрный на жёлтый или зелёный и т. д.). Такое явление получило название Метахромазия.

При соблюдении правил приготовления микропрепаратов и применении стойких красителей постоянные микропрепараты Могут сохраняться десятилетиями, не утрачивая своих первоначальных качеств.

Следует помнить , что ядерные и цитоплазменные красители обычно связываются с окрашиваемыми структурами в количествах, пропорциональных содержанию в них реагирующих компонентов. На этом основана Количественная цито - И гистохимия.

Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры.

Окраска включает использование основного красителя гематоксилина , окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителяэозина Y , окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержатнуклеиновые кислоты (ДНК иРНК ):клеточное ядро ,рибосомы и РНК-богатые участкицитоплазмы . Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточныебелки , например,тельца Леви . Цитоплазма является эозинофильной средой.Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом.

2. Окраска железным гематоксилином

Краситель для микроскопических препаратов. Обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах (парафиновых, криостатных, вибрoтомных, изготовленных на заморажи-вающем микротоме) и цитологических препаратах. Реагент не содержит этанола и метанола. Предназначен для использования в качестве ядерного красителя при окраске соединительной ткани по Ван-Гизону, Маллори, Массону и в других многоцветных методах окраски гистологических препаратов. Достоинствами предлагаемого гематоксилина являются отличное и интенсивное окрашивание ядер клеток в срезах, устойчивость окраски к пикриновой Кислоте и другим слабым кислотам, отсутствие тенденции к перекраске препарата(при соблюдении рекомендаций) и необходимости дифференцировки окраски.

3. Окраска метиленовым синим Лефлера Методика окраски. Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 - 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго. Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Органический основной тиазиновый краситель , применяют для окраскихлопка ,шерсти ,шелка в ярко-голубой цвет, однако окраска слабоустойчива на свету. Ваналитической химии применяется для определенияхлоратов ,перхлоратов ,катионов ртути ,олова ,магния ,кальция ,кобальта ,кадмия .

В медицине используется в качествеантисептика ,антидот при отравлениицианидами ,угарным газом исероводородом . Имеются сообщения о высокой эффективности этого соединения при леченииболезни Альцгеймера .

4. Окраска пикрофуксином

При окраске пикрофуксином набухшие коллагеновые пучки ярко-красного цвета, гомогенные с плохо различимым волокнистым строением. В очагах более резкого поражения коллагеновые пучки неравномерной окраски, местами они ярко-красные, местами с пятнами желтого цвета, местами коричневые. 5. Окраска по Романовскому-Гимзе Приготовление красителя Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии. Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде. Методика окраски 1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40-120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8 - 6,0, для мазка крови - 6,4 - 6,5, для выявления простейших - 6,8, малярийного плазмодия - 7,0 - 7,2. 2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии. Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в красный.

6. Окрашивание конго-красным

Внешний вид - красно-коричневые кристаллы. плохо растворим в холодной воде. В органических растворителях не растворяется.Данный краситель находит применение в микроскопических исследованиях и используется, в виде спиртового, водного или аммиачного раствора для окрашивания клеточной оболочкигрибов (самостоятельно, либо в сочетании сгенциановым фиолетовым ) . Конго красный широко применяется в гистологии для выявления амилоида . Помимо этого "классического" применения, конго красный используется в десятках других процедур окрашивания в зоологии беспозвоночных, ботанических исследованиях, цитологии человека и животных .

Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей

Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т. д.).

Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей.

Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем- цитоплазма.

Ядерные (основные) красители. для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина.

Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Гематоксилин Эрлиха.

Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином.

Железный гематоксилин Гейденгайна

окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта

готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта 1 и раствора Вейгерта 2. Раствор Вейгерта 1 представляет собой 1% раствор гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта 2 имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официальный раствор полуторахлористого железа-это 50% раствор водного хлорного железа (FеСI3* 6Н20). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором соляной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.

Квасцовый кармин приготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания -0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Кислые красители.

Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для до окрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроцитьи красятся в желтый цвет.

Методика окрашивания срезов гематоксилин - эозином.

Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженньие срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-3О мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий:

1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллированной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Гидропическая (вакуольная) дистрофия гепатоцитов

2-Баллонная дистрофия гепатоцитов

3-Воспалительная инфильтрация междольковой соединительной ткани

ЗАНЯТИЕ № 3

ТЕМА: Мезенхимальные дистрофии

№ 18 - АМИЛОИДОЗ ПЕЧЕНИ

Окраска: Конго красный

Балочное строение печени нарушено. Печеночные клетки и балки уменьшены в размерах, а местами вообще не определяются из-за отложения амилоидных масс, окрашенных в красно-оранжевый цвет. Амилоид откладывается в строме печени в стенках сосудов и желчных протоков

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Отложения жира в строме миокарда

2-Атрофия мышечных волокон

№22 -ГИАЛИНОЗ АРТЕРИОЛ СЕЛЕЗЕНКИ

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате селезенки следует найти центральные артериолы фолликулов. Стенка артериол резко утолщена, гомогенизирована, бесструктурна, окрашена в розовый цвет. Просветы артериол сужены, а местами вообще не определяются.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1.Печеночные клетки с пигментом гемосидерином

2. Гемосидерин в строме печени

№ 94 -ДИСТРОФИЧЕСКОЕ ОБЫЗВЕСТВЛЕНИЕ МИОКАРДА

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате виден миокард, в котором имеются разной величины и формы очаги обызвествления, окрашенные в темно-фиолетовый цвет. Они представляют собой группы мышечных волокон, подвергшихся дистрофии и некрозу с последующим пропитыванием их солями кальция. Вокруг очагов обызвествления отмечается лейкоцитарная инфильтрация как результат реактивного воспаления.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1.Атрофия печеночных балок и клеток

2.Зерна липофусцина в печеночных клетках

ЗАНЯТИЕ № 5

ТЕМА: НЕКРОЗ. ОБЩАЯ СМЕРТЬ .

№ 4- ИШЕМИЧЕСКИЙ ИНФАРКТ СЕЛЕЗЕНКИ

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате можно различть три зоны:

первая зона – зона некроза -представлена участком бесструктурной массы (детритом), слабо окрашенным эозином в розовый цвет с наличием осколков ядер; вторая зона – демаркационная зона – характеризуется наличием расширенных сосудов с кровоизлияниями и слабо выраженной инфильтрацией нейтрофилами, что свидетельствует о «свежести» некроза; третья зона- не измененная ткань селезенки.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- Клубочек с сохранившимися ядрами

2- Безъядерные извитые канальцы

3- Прямые канальцы с сохранившимися ядрами

4- Межуточное вещество с сохранившимися ядрами

№5 -ИНКАПСУЛИРОВАННЫЙ ОБЫЗВЕСТВЛЕННЫЙ ОЧАГ

ТВОРОЖИСТОГО НЕКРОЗА В ЛИМФОУЗЛЕ (при туберкулезе)

Окраска: гематоксилин-эозин

Строение лимфоузла нарушено, определяются сливающиеся очаги казеозного некроза, окрашенные эозином в розовый цвет. Кое-где в детрите выявляются осколки ядер, окрашенные гематоксилином в бледно-синий цвет. Вокруг некроза возникло продуктивное воспаление и формируется соединительнотканная капсула.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Очаги творожистого некроза

2- Зона демаркационного воспаления с образованием капсулы

ЗАНЯТИЕ № 6

ТЕМА: НАРУШЕНИЯ КРОВО- И ЛИМФООБРАЩЕНИЯ – 1 занятие.

(полнокровие, малокровие, кровотечение, кровоизлияния, плазморрагия, нарушения содержания тканевой жидкости, нарушения лимфообращения)

№ 1 - МУСКАТНАЯ ПЕЧЕНЬ

Окраска:гематоксилин-эозин

В препарате видна ткань печени. Балочное строение долек печени сохранено, однако центральные вены и впадающие в них синусоиды резко расширены, переполнены кровью. Синусоиды на периферии долек имеют обычный вид. Гепатоциты в центре долек резко уменьшены в размерах, атрофированы, а местами не определяются. Гепатоциты на периферии долек сохранены, местами с дистрофическими изменениями.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- Расширенные и полнокровные центральные вены

2- Расширенные и полнокровные синусоиды центральных отделов долек

3- Атрофия и некроз печеночных клеток в центре долек

4- Сохранившиеся гепатоциты периферических отделов долек

№ 2 -БУРАЯ ИНДУРАЦИЯ ЛЕГКОГО

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате видна ткань легкого с расширенными межальвеолярными перегородками и суженными просветами альвеол. Межальвеолярные перегородки расширены за счет разрастания в них соединительной ткани, а также за счет полнокровия кровеносных сосудов, вокруг которых можно видеть диапедезные кровоизлияния. В межальвеолярных перегородках и в просветах альвеол содержатся скопления макрофагов, поглотивших гемосидерин и называющихся гемосидерофагами (окрашиваются в коричневый цвет). В просветах альвеол можно видеть отечную жидкость, окрашенную эозином в слабо розовый цвет.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Утолщенные и склерозированные альвеолярные перегородки

2-Расширенные и переполненные кровью сосуды

3-Скопления гемосидерофагов

4-Отечная жидкость в альвеолах

Окраска: гематоксилин-эозин

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Полнокровие сосудов легкого

2-Скопление отечной жидкости в полостях легочных альвеол

3-Раковые эмболы в просвете лимфатических сосудов

№81- ОБТУРИРУЮЩИЙ ТРОМБ С ОРГАНИЗАЦИЕЙ, КАНАЛИЗАЦИЕЙ

И ВАСКУЛЯРИЗАЦИЕЙ

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате - поперечный срез сосуда, просвет которого выполнен соединительной тканью, заместившей обтурирующий тромб и остатками тромба. Граница между интимой и соединительной тканью неразличима. Среди соединительной ткани видны множественные мелкие и единичные крупные каналы, выстланные эндотелием (это вновь образованные сосуды).

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Зона некроза

2-Зона демаркационного воспаления

3. Неизмененная ткань почки:

№ 8 -КРАСНЫЙ ТРОМБ В АРТЕРИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Окраска: гематоксилин-эозин

Просвет артерии заполнен гомогенными эозинофильными массами - красным тромбом

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Миокард

2-Фибрин на поверхности эпикарда

3-Грануляционная ткань, врастающая в фибрин.

№ 42 - ГНОЙНЫЙ МЕНИНГИТ

Окраска: гематоксилин-эозин

Мягкие мозговые оболочки резко утолщены преимущественно за счет инфильтрации гнойным экссудатом, состоящим из множества нейтрофильных лейкоцитов. Сосуды оболочек резко расширены, полнокровны. Ткань головного мозга существенно не изменена.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Гнойный экссудат в мозговых оболочках

2-Полнокровные сосуды мозговых оболочек

3-Ткань головного мозга

№ 104- СЕРОЗНО-ГНОЙНАЯ ПНЕВМОНИЯ

Окраска: гематоксилин-эозин

Просветы альвеол выполнены экссудатом различного состава. В одних -экссудат состоит из гомогенной белковой массы, однородно окрашенной эозином в розовый цвет, с небольшой примесью нейтрофильных лейкоцитов и клеток слущенного альвеолярного эпителия, что соответствует серозному воспалению. В других альвеолах в экссудате преобладают нейтрофильные лейкоциты, что характерно для гнойного воспаления. Наличие в одном и том же препарате фокусов серозного и гнойного воспаления позволяет назвать его серозно-гнойной пневмонией. В межальвеолярных перегородках определяются расширенные полнокровные сосуды и слабо выраженная лейкоцитарная инфильтрация.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-серозный экссудат в просвете альвеол

2-гнойный экссудат в просвете альвеол

ЗАНЯТИЕ № 9

ТЕМА: Продуктивное воспаление

№ 52- МИЛИАРНЫЙ ТУБЕРКУЛЕЗ ЛЕГКИХ

Окраска: гематоксилин-эозин

В легочной ткани обнаруживаются множественные гранулемы, состоящие преимущественно из эпителиоидных клеток. В некоторых гранулемах определяются одна-две гигантские многоядерные клетки Пирогова-Лангханса с характерным расположением ядер в виде частокола по периферии клетки. В периферических отделах бугорка обнаруживается вал из лимфоцитов с небольшой примесью плазматических клеток. В некоторых бугорках обнаруживаются фокусы творожистого некроза.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

2-Обызвествленная соединительнотканная капсула

3-Реактивное воспаление вокруг пораженного мышечного волокна

№ 56- ЦИСТИЦЕРКОЗ ГОЛОВНОГО МОЗГА(ветвистая форма)

Окраска: гематоксилин-эозин

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1 – Плазматические клетки

2 –Клетки Микулича

3 –Гиалиновые шары

ЗАНЯТИЕ № 10

ТЕМА: Процессы компенсации и адаптации

№ 55- ЖЕЛЕЗИСТАЯ ГИПЕРПЛАЗИЯ ЭНДОМЕТРИЯ

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате представлен соскоб эндометрия. Эндометрий резко утолщен в связи с наличием большого количества маточных желез (крипт) отличающихся большим разнообразием по величине и форме. Однако все железы выстланы однослойным призматическим эпителием. Строма эндометрия сочная, отечная, местами инфильтрирована лейкоцитами.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Резкое утолщенные мышечные волокна

2-Увеличенные в размерах мышечные ядра

№ 109- ГИПЕРТРОФИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (коллоидный зоб)

Окраска: гематоксилин-эозин

Фолликулы щитовидной железы различной формы, многие из них резко увеличены в размере, заполнены коллоидом. Эпителиальные клетки фолликулов уплощены.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- сосочковые разрастания, покрытые эпителием

№ 67- АДЕНОКАРЦИНОМА ТОЛСТОЙ КИШКИ

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате виден фрагмент стенки толстой кишки, в одном участке которого стенка кишки имеет обычное строение. В другом участке определяется опухоль, представленная атипичными эпителиальными клетками, формирующими атипичные железы. Опухоль инвазирует подслизистый и мышечный слои стенки кишки.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- Гнезда раковых клеток

2-Раковые жемчужины (центры ороговения)

№ 64- СКИРР ГРУДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Окраска: гематоксилин-эозин

Опухоль представлена мелкими группами или скоплениями атипичных гиперхромных малодифференцированных раковых клеток, расположенных среди широких прослоек зрелой волокнистой гиалинизированной соединительной ткани. Таким образом, в опухоли строма преобладает над паренхимой.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- Гнезда опухолевых клеток

2-Гиалинизированная строма опухоли

ЗАНЯТИЕ № 12

ТЕМА: Эпителиальные опухоли органоспецифические

№ 80 -ХОРИОНЭПИТЕЛИОМА

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате представлена ткань матки. В миометрии разрастается опухолевая ткань, построенная из двух видов клеток: 1) клеток округлой и полигональной формы со светлой цитоплазмой и рыхлым, окрашенным в сиреневый цвет ядром (это клетки цитотрофобласта, клетки Лангханса), 2) крупных, уродливой формы клеточных симпластов с интенсивно окра-шенными множественными ядрами. Эти клетки образуют синтиций и называются синтициальными клетками. Описанные два вида клеток имеют сходство с хориальным эпителием ворсин, который является источником развития опухоли. Между клетками опухоли имеются кровяные лакуны, или «озера». Собственная строма в опухоли отсутствует.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1 - Крупные полигональные клетки, формирующие разной величины островки

2 - Узкие прослойки соединительной ткани, разделяющие клеточные островки опухоли

№ 15 -ФИБРОАДЕНОМА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Окраска: гематоксилин-эозин

Опухоль состоит из 2 компонентов: а) причудливо разрастающихся резко деформированных протоков с едва различимыми просветами; б) соединительной ткани. В одних участках опухоли соединительная ткань разрастается концентрически вокруг протоков и поэтому фиброаденома называется периканаликулярной, в других - соединительная ткань выпячивается в просвет протоков, их просвет становится щелевидным, что называется интраканаликулярной фиброаденомой.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- опухолевые клетки, расположенные концентрически

2- псаммозные тельца

№ 108- НЕВРИНОМА (ШВАННОМА)

Окраска: гематоксилин-эозин

В препарате видна опухоль, построенная из клеток шванновской оболочки периферических нервных стволов. Она состоит из однородного цитоплазматического синтиция с наличием палочковидных ядер, образующих группы, в виде палисадных фигур - это полисадные структуры или тельца Верокаи.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Пучки гладкомышечных волокон

2-Пучки соединительнотканных волокон

ЗАНЯТИЕ № 14

ТЕМА: Опухоли кроветворной и лимфатической тканей

№ 32 -ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗ

Окраска: гематоксилин-эозин

Строение лимфоузла резко изменено. В нем разрастается опухолевая ткань, состоящая из многоядерных клеток Березовского-Штернберга-Рид, больших и малых клеток Ходжкина. Определяются также эозинофилы, а количество лимфоидных клеток резко уменьшено. Кроме этого отмечаются склероз и очаги некроза опухоли.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Дольки печени

2-Скопления лейкозных клеток по периферии долек (лимфомы)

№141- ПЕЧЕНЬ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОИДНОМ ЛЕЙКОЗЕ

Окраска: гематоксилин-эозин

По ходу синусоидов внутри печеночных долек и в меньшей степени в портальных трактах отмечается диффузное разрастание лейкозных клеток миелоидного ряда.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1. Диффузная лейкозная инфильтрация

ЗАНЯТИЕ № 15

ТЕМА: Атеросклероз. Артериальная гипертензия. Ишемическая болезнь сердца. Сосудистые заболевания нервной системы.

№ 8- ДИАПЕДЕЗНЫЕ КРОВОИЗЛИЯНИЯ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ

Окраска: гематоксилин-эозин

В ткани головного мозга видны мелкие и более крупные кровоизлияния, которые расположены преимущественно вокруг расширенных и резко полнокровных сосудов. Стенки сосудов местами неразличимы вследствие обильного пропитывания их эритроцитами. Кое-где можно видеть глыбки бурого пигмента гемосидерина, свидетельствующие о начале рассасывания ранее излившихся кровяных масс.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- Некротизированные мышечные волокна, лишенные ядер

2- Клеточная инфильтрация и очаги кровоизлияний

3- Нормальная мышечная ткань

№ 130- АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКАЯ БЛЯШКА КОРОНАРНОЙ АРТЕРИИ

Окраска: пикрофуксином по Ван-Гизон

Просвет артерии резко сужен в связи с резким диффузным утолщением стенки за счет отложения липоидных масс с последующим разрастанием в ней соединительной ткани. Внутренняя эластическая мембрана оттеснена к средней оболочке.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-Очаг дезорганизации

2-Тромботические массы

3-Воспалительная инфильтрация

4-Разрастание соединительной ткани.

№ 83- РЕВМАТИЧЕСКИЙ МИОКАРДИТ

Окраска: гематоксилин-эозин

В расширенных межмышечных прослойках вокруг сосудов видны гранулемы. Это клеточные инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов, а также – фибробластов.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1-разрастание опухоли - аденокарциномы

№ 93 - ХРОНИЧЕСКАЯ ЯЗВА ЖЕЛУДКА С ОБОСТРЕНИЕМ

Окраска: гематоксилин-эозин

В стенке желудка имеется глубокий дефект, захватывающий слизистую и подслизистую оболочки. В области дефекта один край слизистой оболочки подрыт, другой пологий. В дне дефекта определяются: а) фибринозно-гнойный экссудат, б) фибриноидный некроз, в) грануляционная ткань, г) соединительная ткань.

О Б О З Н А Ч Е Н И Я:

1- Обильная инфильтрация слоев стенки отростка лейкоцитами

2- Язвенные дефекты в слизистой отростка

№ 144- ОСТРЫЙ ПАНКРЕАТИТ

©2015-2019 сайт
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2016-08-07

Страница 47 из 68

Окрашивание гематоксилин-эозином (фиксация любая)

Этот метод самый распространенный в гистологической практике, так как благодаря удачному сочетанию красителей, относящихся к двум противоположным группам, позволяет получить общее представление о состоянии исследуемых органов и тканей.
Гематоксилин - природный краситель растительного происхождения, растворимый в воде, спирте и глицерине*.

* Последнее обстоятельство является противопоказанием к заключению в глицерин срезов, окрашенных гематоксилином.

В растворе гематоксилин обладает основными свойствами, благодаря чему хорошо выявляет структурные компоненты ядра, которые содержат нуклеиновые кислоты. Однако красящим свойством обладает не сам гематоксилин, а продукт его окисления -гематеин.
Эозин - искусственный краситель, растворимый в воде или спиртах, обладает кислотными свойствами, окрашивает цитоплазму клеток в розовый цвет.
Существуют многочисленные способы приготовления красящих растворов из гематоксилина, но суть их одна - его окисление.
Приводим наиболее распространенные рецепты.
Кислый гематоксилин Эрлиха. В 100 мл 96% спирта растворить 2 г гематоксилина, прибавить 100 мл дистиллированной воды, затем 100 мл чистого глицерина, 3 г калийных квасцов (химически чистых) и 10 мл ледяной уксусной кислоты, взболтать и оставить на свету «созревать» в течение 14 дней, периодически взбалтывая. Для того чтобы обеспечить постоянный доступ воздуха (процесс окисления гематоксилина), следует брать широкогорлый сосуд и накрывать входное отверстие несколькими слоями марли. В процессе «созревания» раствор из светло-красного становится темно-красным. В плотно закрытом сосуде краситель сохраняет свойства длительное время.
Гематоксилин Бемера. В 10 мл 100% спирта растворить 1 г кристаллического гематоксилина и добавить 200 мл 10% водного охлажденного и профильтрованного раствора калийных квасцов. Раствор «созревает» на свету в течение 4-5 дней, после чего им можно пользоваться. Перед употреблением раствор красителя каждый раз фильтруют. Со временем он портится.
Кислый гемалаун Майера. В 1000 мл дистиллированной воды растворить 1 г гематоксилина, добавить 0,2 г йодата натрия (NaIО3), 50 г калийных квасцов (химически чистых) и, непрерывно помешивая, дождаться их полного растворения (при этом жидкость приобретает фиолетово-синюю окраску). Затем добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты, в результате чего раствор становится фиолетово-красным. В хорошо закрытом сосуде из химически чистого стекла краситель хранится длительное время.
Преимущество данного метода - быстрое окисление гематоксилина йодатом натрия, благодаря чему раствор не требует «созревания» и сразу может употребляться для окрашивания.
Приготовление красящего раствора из гематеина: а) 1г фабричного гематеина растворяют в 50 мл 96% спирта (при слабом подогревании); б) 5 г калийных квасцов (химически чистых) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Затем сливают оба раствора, фильтруют и добавляют немного тимола (для консервации). Применяют без «созревания». Раствор хорошо сохраняется в плотно закрытом сосуде.
Приготовление эозина: 0,1 красителя растворяют в 100мл дистиллированной воды.
Перед окрашиванием необходимо подготовить рабочее место, убрать в сторону все лишние предметы, установить микроскоп и освещение к нему, расставить в определенном порядке посуду с соответствующими жидкостями, проверить состояние «батарей» для обезвоживания и просветления препаратов, отфильтровать красящие растворы, подготовить покровные (а если нужно, и предметные) стекла и т. д. Лишь после этого можно приступать к окрашиванию препаратов.
Методика окрашивания. Начинать следует с определения продолжительности, так как она находится в зависимости от способа фиксации, характера и свойств препарата и самих красителей и т. д. Для этого извлекают из дистиллированной воды три стекла со срезами (доведение препаратов до воды - см. предыдущий раздел), удаляют излишки влаги вокруг них (иначе краска растечется по всему стеклу и разбавится водой), кладут в горизонтальном положении и накапывают пипеткой раствор красителя до полного покрытия препарата. Через 2 мин сливают красящий раствор* с одного из стекол и помещают его в дистиллированную воду (для отмывания излишков красителя). Два оставшихся стекла освобождают от гематоксилина через 4-6 мин соответственно. После этого, вытерев тыльную сторону стекла, препарат рассматривают при малом увеличении микроскопа (если нужно, то и при большом, накрыв препарат покровным стеклом). При окраске свободноплавающих срезов с помощью крючочков переносят несколько срезов в краситель, налитый на часовое стекло или в низкий бюкс, а затем через такие же промежутки времени извлекают, промывают в дистиллированной воде, расправляют на чистом предметном стекле и рассматривают в микроскоп.
Возможные варианты результатов: а) ядра окрашены в светло-фиолетовый цвет без четкого различия микроструктур - препарат недокраш е н; б) ядра темно-фиолетовые (почти черные, но с красноватым оттенком), структурные элементы расплывчаты, цитоплазма тоже окрашена - препарат перекрашен; в) ядра красно-фиолетовые с отчетливо выраженными ядрышком и хроматином, цитоплазма светлая, неокрашена - окраска нормальная.

* Краситель сливают в сосуд, откуда его брали, так как он пригоден к дальнейшему употреблению.

Установив оптимальное время окрашивания гематоксилином, в течение 3-5 мин отмывают излишки красителя в дистиллированной воде и затем помещают препараты в водопроводную воду, где они находятся до приобретения синей окраски (10-14 мин) вследствие посинения ядер в слабощелочной среде (водопроводную воду можно заменить дистиллированной, слегка подщелочив ее аммиаком). После этого препарат вновь помещают на 3-5 мин в дистиллированную воду.
Помимо изложенного выше прогрессивного метода окраски ядер гематоксилином, существует регрессивный метод. Срез с перекрашенными ядрами после промывания в дистиллированной воде помещают на 1-6 с в подкисленный 70° спирт (5-7 капель крепкой хлористоводородной кислоты на 100 мл спирта) и под контролем микроскопа следят за ослаблением окраски (ослабевает фиолетовый и усиливается красноватый тон ядер). Дальнейшая обработка обычная.
Окраску ядер гематеином и кислым гемалауном Майера производят таким же способом, но необходимо особенно тщательно промыть препарат, так как неудаленный остаток кислоты может нарушить окраску.
По окончании промывки окрашенного гематоксилином препарата в дистиллированной воде его вновь извлекают, удаляют излишнюю влагу и накапывают раствор эозина. Время окраски также подбирают опытным путем, варьируя экспозицию от 1 до 4-5 мин.
Возможные варианты: а) окрашенная цитоплазма и внеклеточные образования имеют едва заметный розоватый или желтоватый оттенок - препарат недокрашен; б) общий фон интенсивно красного цвета, микроструктуры видны нечетко, граница ядер расплывчата - препарат перекрашен; в) общий фон умеренно розовато-желтого цвета, ядра четко контурируются - окраска удачная.
После того как окрашивание эозином закончено, краситель сливают обратно во флакон (как и гематоксилин, он может употребляться многократно), препарат ополаскивают в дистиллированной воде, проводят через спирты восходящей концентрации, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
Следует знать, что эозин легко вымывается в воде и спиртах низкой концентрации, поэтому проводить препарат через эти жидкости следует быстро, лишь окунув несколько раз, и только в 96% и 100% спирте можно держать 1-2 мин. Если препарат перекрашен эозином, то излишнюю окраску следует удалить, увеличив время промывания (в дистиллированной воде) и проведения через слабые спирты.
Для усиления красящих свойств эозина применяют подкисление раствора красителя уксусной кислотой (1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл красителя).
Помимо описанного двойного метода обзорной окраски препаратов, применяются и другие.
Существуют красители, окрашивающие ядра в красный цвет (сафранин, квасцовый кармин), а цитоплазму - в зеленый (световой зеленый), оранжевый (оранжевый Г).

Окрашивание железным гематоксилином по Гейденгайну

(фиксация любая, но наилучшие результаты после сулемовых и хромовых фиксаторов)

Железный гематоксилин в отличие от приведенных выше гематоксилиновых растворов окрашивает не только ядра, но и различные цитоплазматические и некоторые межклеточные структуры. Это свойство основано на том, что перед окрашиванием препарат протравливают в растворе железоаммониевых квасцов, которые по-разному воспринимаются различными тканевыми элементами. Последующая обработка протравленных тканей гематоксилиновым раствором приводит к образованию черного железно-гематеинового лака, который в процессе дифференцировки срезов частично уходит из тканей обратно в раствор. Таким образом, по типу окрашивания железный гематоксилин - типичный регрессивный краситель.
Из сказанного следует, что, варьируя время протравливания, окрашивания и дифференцировки, можно получать различный конечный эффект в зависимости от целей исследования (выявить только ядерные структуры или одновременно цитоплазматические и внеклеточные образования).
Приготовление растворов. 1. Раствор железоаммониевых квасцов. Растворить 10 г железоаммониевых квасцов (сульфат аммиака-железа) в 100мл дистиллированной воды. Можно употреблять только светло-фиолетовые кристаллы. Желтые, зеленоватые, беловатые кристаллы применять не следует.

1. Раствор гематоксилина. Растворить 1 г гематоксилина в 10 мл 96% спирта и разбавить дистиллированной водой до 100 мл, отметив уровень жидкости в сосуде, затем оставить для «созревания» на 4-5 нед, обеспечив постоянный доступ света и воздуха (для этого горлышко сосуда надо прикрыть сложенной в несколько слоев марлей и по мере испарения доливать воду до исходного уровня). В процессе созревания раствор меняет светло-коричневую окраску на темно-коричневую. Перед употреблением раствор разбавляют равным количеством дистиллированной воды.

Если нужно обеспечить быстрое приготовление раствора гематоксилина (без созревания), то к раствору, приготовленному по описанному выше рецепту, добавляют 0,1 г йодата натрия (NaIО3), который быстро окисляет гематоксилин в гематеин и делает краситель пригодным к употреблению через 1 ч после приготовления.
Проведение окрашивания. Предварительная обработка. Находящиеся в дистиллированной воде срезы переносят в 2,5% раствор железоаммониевых квасцов (приготовленный путем разбавления дистиллированной водой исходного 10% раствора) и оставляют на 3-12 ч.
Процесс протравливания можно значительно ускорить (до 1-3 мин), поместив сосуд со срезами в термостат при 37°С. По окончании протравливания раствор сохраняют.
Окрашивание. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы помещают в разбавленный (вдвое) раствор гематоксилина на 1-36 ч, до полного почернения (лучше перекрасить, чем недокрасить). Как и при протравливании, время окраски можно сократить (до 2-3 ч - 30 мин) путем помещения сосуда с красящимися срезами в термостат при 37°С.
Дифференцировка. Это самый ответственный этап окрашивания. Окрашенные срезы тщательно отмывают в двух-трех порциях дистиллированной воды (7- 10 мин) и помещают в раствор железоаммониевых квасцов, служивший для протравливания. Степень дифференцировки периодически контролируют в микроскоп. Для этого срез ополаскивают в дистиллированной воде и рассматривают при нужном увеличении (вплоть до водной иммерсии, накрыв предварительно покровным стеклом). Если процесс дифференцировки идет быстро, то следует уменьшить концентрацию раствора железоаммониевых квасцов, разбавив его дистиллированной водой.
Получив окраску нужной степени, срезы тщательно промывают в проточной или часто сменяемой водопроводной воде в течение 10-12 мин (недостаточное отмывание дифференцирующей жидкости приводит к обесцвечиванию препаратов), затем ополаскивают в дистиллированной воде, обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.

Быстрый метод окрашивания железным гематоксилином по Гурвичу

В случае необходимости срочного окрашивания срезов железным гематоксилином Гейденгайна применяют у скоренный метод Гурвича (реактивы те же).
Вынув стекло со срезами из дистиллированной воды, промокают срез гладкой фильтровальной бумагой и покрывают 2,5% раствором железоаммониевых квасцов. Затем тыльную сторону стекла подогревают над спиртовкой до образования пара (не перегревать!) и, дав немного остыть, повторяют процедуру нагревания еще 2-3 раза. После этого сливают квасцы, не промывая срез, накапывают гематоксилин и вновь подогревают до появления паров. Окраску ведут до тех пор, пока срез не приобретает сине-черный цвет. Затем его промывают в дистиллированной воде, заливают квасцами и следят за ходом дифференцировки в микроскоп. По окончании дифференцировки срез тщательно отмывают от квасцов (в двух-трех сменах дистиллированной воды, а затем в проточной), обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам. При работе со свободноплавающими срезами рекомендуется предварительно наклеить их на предметное стекло сразу же по извлечении из воды и вести окраску, как описано. Обработка срезов в свободноплавающем состоянии может дать неравномерную окраску.
Общие замечания. Приведенное выше описание протравливания, окраски и дифференцировки зависит от многих факторов (качество реактивов, свойство изучаемого объекта, цели и задачи исследования и т. д.) и устанавливается опытным путем в каждом конкретном случае. Наиболее ответственным этапом окрашивания является дифференцировка, так как отдельные структурные компоненты клеток и тканей с различной скоростью отдают обратно накопленный краситель. Быстрее всех обесцвечивается гомогенная часть цитоплазмы, затем ее гранулярные компоненты и в последнюю очередь структурные элементы ядра.
При работе с целлоидиновыми срезами следует предварительно освободить препарат от целлоидина (см. соответствующий раздел), так как он значительно подкрашивается железным гематоксилином и не обесцвечивается при дифференцировке. Растворение целлоидина следует производить до протравливания в железоаммониевых квасцах, так как после него растворимость значительно ухудшается.

Этикетирование предметных стекол

После наклейки срезов (или непосредственно перед ней) на предметное стекло необходимо нанести соответствующие обозначения. Особенно это важно при серийных срезах и при обработке экспериментального материала. Конкретное содержание пометок зависит от характера исследования и от установок, принятых в той или иной лаборатории. Наиболее надежный способ - выцарапывание знаков специальными карандашами с наконечниками из твердых сплавов типа «победит». Менее надежны надписи тушью. Существуют различные приемы, чтобы тушь при обработке в жидких средах не смывалась и не размазывалась: а) до наклеивания срезов один из концов предметного стекла, смазанный белком с глицерином, нагревают над огнем до появления дыма, после охлаждения наносят на данный участок необходимые обозначения и снова прогревают над пламенем; б) наносят соответствующую надпись, а затем опускают эту часть стекла в 1-2% раствор целлоидина для образования защитной пленки и т. д.