Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена. Опыты с ферментами: оксидазы и пероксидазы
ях между ними [Воронова и др., 1981]. Применение хрома-тографических методов исследований позволило выделить два белка с пероксидазной активностью и изучить некоторые каталитические свойства их в опыте и контроле [Андреева и др., 1979; Андреева, 1981]. Это дало возможность получить новую информацию об активности изопероксидаз вирозных растений.
Из работ, вышедших за последнее время, наибольшее внимание заслуживает коллективный труд авторов «Биохимия иммунитета, покоя, старения растений» , выполненный в Институте биохимии им. А. Н. Баха. Изучая различные стороны метаболизма растений, пораженных грибными заболеваниями, авторы дают анализ различных биотических индукторов защитных реакций растений и возможные пути их практического использования. Однако в нем не проанализированы сведения о биохимии защитных реакций растений, зараженных вирусами. Взаимодействие растений-хозяев и вирусов, их поражающих, происходит иначе, чем при заражении грибами и бактериями, так как у вирусов нет
собственной ферментной системы. Вирус индуцирует в клетках растений* процессы, полностью зависящие от метаболических путей хозяина. К тому же один и тот же вирус может вызывать различную реакцию у разньш хозяев, а разные вирусы - неидентичные реакции у одного и того же хозяина. В настоящее время мы имеем, как правило, разрозненный мате* риал, полученный на растениях-хозяевах в различные сроки заражения и взятия проб для эксперимента. Исследователи выделяют отдельные мета4 болические реакции и на их основе пытаются понять взаимодействие вирус-растение. Очевидно, совершенно необходимо проводить исследования на одном растении-хозяине, поражаемом как вирусным, так и грибным заболеванием, в целях четкого понимания общих закономерно! стей и определенных различий в путях иммунных процессов инфицирован-, ных растений.
Современная сельскохозяйственная практика (посев семенами одного сорта на больших площадях, применение фунгицидов, инсектицидов и т. д.) способствует возникновению новых рас патогенов, которые могут в сильной степени поражать ранее устойчивые сорта растений. Если в прежние годы сорта могли сохраняться 2-3 десятилетия, то теперь устойчивость к возбудителям теряется уже через 5-7 лет [Конарев, 1985]. В условиях промышленного возделывания растений из природной популяции могут выделяться и накапливаться сильновирулентные штаммы вирусов, поражающие постоянно высеваемые культуры. Все это определяет необходимость глубокого изучения биохимических основ механизмов фитоиммунитета, а полученные теоретические разработки более эффективно использовать для приемов борьбы и защиты растений от патогенов.
Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО АН СССР кандидатам химических наук Олегу Борисовичу Максимову, Раисе Петровне Горшковой и Нине Арвидовне Василевской за консультацию и помощь в выполнении работ по определению углеводов и фенольных соединений, а также Светлане Ильиничне Омельченко, принимавшей активное участие в проведении совместных исследований.
ПЕРОКСИДАЗА - ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ
1.1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА
Проявление пероксидазной функции у биологических объектов было замечено еще в прошлом веке, на заре изучения органических веществ. Самое раннее сообщение о пероксидазе появилось в 1855 г., после того как Шенбейн провел окисление ряда органических соединений разбавленными растворами перекиси а присутствии экстрактов из растений и животных . Название «пероксидаза» дал Линозье ферменту, выделенному им из гноя лизированных лейкоцитов и катализирующему окисление разных соединений за счет перекисного кислорода (Linossier, 1898, цит. [Михлин, 1947]). Линозье первым привел различия между «оксидазами» и «пероксидазами». Как пишет Д. М. Михлин, выделением пероксидазы в сравнительно чистом виде и изучением основных ее свойств мы обязаны Алексею Николаевичу Баху и его сотрудникам. В 1903 г. они выделили пероксидазу, относительно свободную от других ферментов (в том числе от каталазы), чем было окончательно опровергнуто долгое время господствовавшее мнение о тождественности пероксидазы и каталазы.
А. Н. Бах и Р. Шода для оценки активности растительной пероксидазы использовали окисление пирогаллола до окрашенного пурпурогаллина (Bach, Shodat, 1903, цит. по: [Роговин и др., 1977]). Они нашли, что скорость образования пурпурогаллина пропорциональна концентрации.фермента и перекиси водорода. Этим методом пользуются биохимики и поныне для оценки активности как растительных, так и животных пероксидаз. В дальнейших исследованиях были определены оптимум действия пероксидазы, температурная зависимость, оптимум концентрации водородных ионов, установлено также значение концентрации субстрата в реакциях с ферментом и т. д. Для уровня исследований тех лет это было значительным шагом вперед в области изучения белков-ферментов растений. Именно тогда А. Н. Бахом была высказана гипотеза об участии перекисей в окислении органических соединений.
С годами интерес к ферменту пероксидазе не ослабевал. В 30-50-е годы внимание многих исследователей было приковано к таким геми-новым белкам, как пероксидаза, каталаза, цитохромы и гемоглобин. Подтверждением тому служит работа Д. М. Михлина «Пероксиды и пероксидазы», вышедшая в 1947 г. В 60-70-е годы большое внимание уделялось пероксидазам больного растения на кафедре физиологии
растений МГУ членом-корреспондентом ВАСХНИЛ Б. А. РубиныЛ и его сотрудниками. В 80-е годы на кафедре химической энзимологии МГУ, возглавляемой членом-корреспондентом АН СССР И. В. Бере! зиным, успешно велось изучение каталитических свойств пероксидазы, вы! деленной из растений хрена. Согласно сводке литературы, представленное швейцарскими и канадскими исследователями, только с 1970 по 1980 г. вышло из печати 1600 научных статей , посвященных этому ферменту. В них освещены различные стороны физико-химического строения, биологического действия и участия в метаболических процессах пероксидаз, в основном растительного происхождения. Представленный авторами список работ не является полным, так как не были учтены работы, касающиеся пероксидаз микро- и макроорганизмов.
Повышенное внимание к этому ферменту прежде всего вызвано тем, что до сих пор остается невыясненным наличие большого набора изоэнзимов (от 3 до 42) у многих исследуемых растительных пероксидаз. Скандалиоз считает пероксидазы «семейством» ферментов со сходными физиолого-биохимическими свойствами, где многое еще необходимо выяснить . Другой, не менее интересный вопрос заключается в широкой субстратной специфичности или, в узком понимании этого определения, в отсутствии таковой для пероксидаз. Установлено, что пероксидазы неспецифичны в отношении доноров водорода, но строго специфичны а отношении второго субстрата - перекиси водорода при проявлении пероксидазной функции фермента. Возможное участие пероксидаз в защитных реакциях или в других проявлениях патогенеза также способствует сохранению постоянного внимания исследователей к этому ферменту.
1.2. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ
Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание активной группы, вступающей в химическое взаимодействие с субстратами, и коллоидального белкового «носителя», усиливающего каталитическое действие этой группы. Это глобулярный белок диаметром 50 A , который содержит около 43% а-спираль-ных участков в составе белковой части молекулы . По номенклатуре ферментов, принятой на Международном биохимическом съезде в 1979 г., пероксидаза - фермент, действующий на перекись водорода в качестве акцептора. Единственный подподкласс (1.11.1) составляют пероксидазы, где под кодовым номером семь стоит истинная пероксидаза - донор: Нг СЬ-оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.7), о каталитическом действии которой более подробно будет сказано ниже.
Изученные до настоящего времени пероксидазы состоят из неокрашенного гликопротеина и соединенного с ним коричнево-красного ферри-порфирина. Геминовая часть молекулы (гем, гемин)-железопротопор-фирин IX представлен на рис. 1. Выполняя роль активного центра, он участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают радикалы соответствующих субстратов . Простетическая группа пероксидаз хрена и японской редиски, цитохрома с, хлоропероксидазы известна как феррипротопорфи-рин IX. Полагают, что все известные пероксидазы и их изоформы содержат этот гем, поскольку они ингибируются азидами и цианидами.
Пероксидаза
Протогематин IX Гликопротеин
Fe3* Протопорфирин IX
Феррипротопорфирин IX входит в активный центр, составляя порфи-риновое кольцо гема, являющегося высокоароматичным и гидрофобным соединением. Именно гидрофобное взаимодействие порфиринового макроцикла с белком формирует третичную структуру нативной пероксидазы. Известно, что протопорфирин оказывает важное стабилизирующее влияние на белковую глобулу гемсодержащих ферментов. Так, комплексообра-зование апопероксидазы хрена с гемином резко повышает устойчивость белка к действию ультрафиолета и тепла. Удаление простетической
группы фермента ведет к потере пероксидазной активности, но не ска1 зывается на ее оксидазной функции .
Хилл и Холден в 1926 г. впервые добились успеха в расщеплении молекулы пероксидазы на простетическую группу и протеин, применяв обработку соляной кислотой и ацетоном . Маэли , используя различные приемы щелочного и кислотного гидролиза гем-протеиновой связи, показал, что при нейтрализации щелочью НСЫ расщепляющего раствора в присутствии подходящего буфера происхо-1 дит рекомбинация протогемина и протеина в активную пероксидазу] И эта обратимая реакция может быть повторена несколько раз с тем же энзимом без заметных потерь активности. Автор также отметил, чтя белок пероксидазы хрена устойчив при щелочном рН, а цвет ге
Перекись водорода, образующаяся в процессе двухэлектронного восстановления кислорода или более сложным путем, например, при дисмутации супероксид-анионов разрушается пероксидазами и каталазами.
Пероксидазы катализируют двухэлектронное восстановление Н202 до Н20, используя в качестве донора электронов различные восстановители:
Н202 + SH2 - 2Н20 + S
Пероксидазы широко распространены в растительных тканях, где они находятся в пероксисомах.
В животных организма фермент содержится в слюне, печени, почках, лейкоцитах и других органах и тканях. Несколько изоформ пероксидаз (лактоперокси- даза, миелопероксидаза лейкоцитов, цитохром-С-пероксидаза дрожжей, пероксидаза хрена) выделены в кристаллической форме. Все перечисленные пероксидазы активируют Н202 и ROOH, а также имеют много общего в их свойствах, так как в качестве простетической группы содержат железопорфирин. В отличие от цитохрома Р450 пятым лигандом иона железа является гистидин, а шестое координационное место могут занимать различные лиганды (Н20, CN и др.). По-видимому, обмен лигандов в шестом положении имеет существенное значение для функционирования пероксидаз.
Максимум поглощения фермента в окисленной форме составляет 420 и 541 нм, а в восстановленной - 432, 535 и 565 нм. Пероксидаза в своей структуре содержит высокоспиновое железо (Fe3+) и по своим свойствам напоминает мет- гемоглобин (раздел 8.1.3). При восстановлении (Fe2+) фермента возможно необратимое присоединение кислорода (оксиперокси- даза).
Механизм действия пероксидаз еще во многом неясен. При его изучении особенно большое внимание уделяется различным окислительно-восстановительным состояниям фермента, которых может быть не менее пяти: Fe2+, Fe3+, комплексы I-III .
Не вдаваясь в подробности электронной структуры комплекса 1, которая детально рассмотрена в работах отметим, что он содержит два окислительных эквивалента.
Один из них локализован на ионе железа, а другой - на порфириновом кольце гемопротеина.
Комплекс 1 неустойчив и легко превращается в соединение красного цвета с максимумом поглощения при 417, 530 и 561 нм. Это так называемый комплекс II. Титрование показывает, что комплекс I превращается в комплекс II одноэлектронным восстановлением.
Избыток Н202 приводит к образованию комплекса III, обладающим максимумом поглощения при 417, 545 и 583 нм. По своим свойствам и действию он аналогичен оксипероксидазе и по спектральным характеристикам напоминает оксимиоглобин и оксигемоглобин. Однако предполагается, что кислород в комплексе III более активирован, чем в названных гемопротеинах.
Пероксидаза катализирует незначительное число реакций окисления ксенобиотиков, в том числе и лекарственных средств. Это могут быть реакции окисления аминов, фенолов, периодиро- вания, переалкилирования .
Единого механизма реакций окисления ксенобиотиков перок- сидазой не существует. По-видимому, окисляющими агентами здесь выступают комплексы I и II. Предполагается, что в процессе окисления ксенобиотиков происходит образование тройного комплекса (перекись водорода-пероксидаза-субстрат):
Отмечено , что как и в случае CYP при окислении фенил- гидразина пероксидазой в качестве продукта реакции образуется фенильный радикал, алкилирующий гем (раздел 10.2).
Значительную роль в клетке играет и глутатионперокси- даза, эффективная при низких концентрациях перекиси водорода. Этот фермент также катализирует процессы с участием гидроперекисей липидов, что особенно важно в реакциях со- окисления лекарств (раздел 8.1.1.5).
Введение
Тиреоидные гормоны трийодтиронин (Т3) и тироксин (Т4) имеют важное значение во многих процессах регуляции метаболизма. Ключевым ферментом биосинтеза Т4 и Т3 является тиреоидная пероксидаза (ТПО), которая катализирует две реакции: окисление ионорганического йодида (I-) и связывание йодированных тирозинов. Щитовидная железа (ЩЖ) является органом-мишенью при многих аутоиммунных заболеваниях (АЗЩЖ), таких как болезнь Грейвса, протекающая с тиреотоксикозом, и тиреоидит Хашимото, который приводит к гипотиреозу. Характерной особенностью этих заболеваний является потеря иммунологической толерантности к тиреоидной пероксидазе, а специфическим маркером этих заболеваний являются антитела к тиреоидной пероксидазе. Таким образом, помимо того что ТПО имеет важнейшую функцию в процессе синтеза тиреоидных гормонов, это еще и один из основных антигенов при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ.
Экспрессия гена ТПО
Тиреоидная пероксидаза — ключевой фермент в процессе биосинтеза тиреоидных гормонов и один из трех главных антигенов при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Помимо ТПО, к ним относятся тирео-глобулин — основной компонент коллоида и рецептор ТТГ, который располагается на базальной мембране фолликулярных клеток ЩЖ. ТПО является гликозилированным трансмембранным белком 1-го типа, который локализуется в апикальной части фолликулярных клеток, где обычно осуществляются важнейшие этапы синтеза тиреоидных гормонов — окисление и органификация йода. ТПО катализирует окисление йода, йодирование остатков тирозина и соединение йодтирозинов с образованием йодтиронинов Т4 и Т3. Таким образом, ТПО играет ключевую роль в биосинтезе тиреоидных гормонов и необходима для нормального функционирования ЩЖ .
Ген ТПО человека локализуется на коротком плече хромосомы 2 и содержит 17 экзонов и 16 интронов общим объемом 16 килобаз . ДНК ТПО содержит 3048 пар оснований и кодирует белок, состоящий из 933 аминокислот, с крупным экстрацеллюлярным фрагментом, коротким одиночным трансмембранным сегментом и коротким цитоплазматическим хвостом . Экспрессия ТПО находится под контролем специфических факторов транскрипции, таких как TTF-1, TTF-2 и PAX-8 . В начале были изолированы две матричные ДНК ТПО : ТПО-1, которая кодирует полноцепочечный белок, и более короткая ТПО-2, кодирующая полипептид, в котором отсутствуют 57 аминокислотных остатков вследствие делеции 171-й пары оснований в экзоне 10. Кроме того, в фолликулярных клетках были идентифицированы фрагменты мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга: ТПО-3 (экзон 16), ТПО-4 (экзон 14) и ТПО-5 (экзон 8) , а также мультисплайсинга: ТПО 2/3 (делеция экзонов 10 и 16), ТПО 2/4 (делеция экзонов 10 и 14) и ТПО-6 (делеция экзонов 10, 12, 13, 14 и 16) . Среди всех изоформ ТПО только ТПО-1, ТПО?3 и ТПО-4 обладают ферментативной активностью . ТПО-2 неактивна, поскольку лишена способности связывать гем из-за отсутствия His 586 и Asn 579 . Сплайсинговые варианты мРНК ТПО экспрессируются на различном уровне в нормальной ткани ЩЖ и при различной патологии, например при раке ЩЖ . Продукты транскрипции ТПО-2, ТПО-5 и мультисплайсинговых вариантов быстро деградируют, поскольку они не способны достичь клеточной поверхности, тогда как полипептиды ТПО-3 и ТПО-4 правильно встраиваются в апикальную мембрану, но ни физиологическое, ни патофизиологическое значение этих соединений неизвестно.
Структура белка ТПО
ТПО относится к суперсемейству пероксидаз животных (оксидоредуктазы, ЕС 1.7.1.11), семейству миелопероксидаз, которое, кроме того, включает миелопероксидазу гранулоцитов (МПО), лактопероксидазу (ЛПО), слюнную пероксидазу и пероксидазу эозинофилов (ЭПО) . Сверка первичной структуры пероксидаз показала, что этим ферментам свойственен высокий уровень гомологии внутри одного семейства . Аминокислотная последовательность ТПО человека в высокой степени сходна с ТПО свиньи, крысы и мыши за исключением вариации N- и С-концов . В эктодомене ТПО (остатки 1-848) присутствуют пять содержащих аспарагин потенциальных мест гликозилирования (Asn 129, 307, 342, 478, 569). Гликозилирование аспарагина 478 маловероятно, поскольку пролин присутствует в позиции Х в общей последовательности Asn-X-Thr . В свиной молекуле ТПО на долю углеводов приходится около 10 % молекулярного веса, при этом только 4 из 5 потенциальных мест гликозилированы . Экстрацеллюлярный С?конец ТПО по структуре гомологичен доменам белков контроля комплемента (БКК-подобный), C4b-b2 гликопротеину и эпидермальному ростовому фактору
(ЭРФ?подобный) .
Структурная гомология позволяет предположить, что молекула человеческого ТПО (чТПО) состоит из трех модулей, аналогичных миелопероксидазе (МПО-подобный), белкам контроля комплемента (БКК-подобный) и эпидермальному фактору роста (ЭРФ-подобный) . С целью определения пространственной структуры трех фрагментов ТПО были получены ее кристаллы, но они оказались слишком малы для проведения кристаллографического анализа; самые большие кристаллы оказались способны преломлять рентгеновские лучи лишь с малым разрешением . По сравнению с другими ТПО первичная структура человеческого фермента (остатки 1-735) обладает наибольшим сходством (42 %) с МПО, что предполагает общее происхождение этих двух ферментов и схожесть их трехфрагментной пространственной структуры . Среди пероксидаз млекопитающих МПО является единственным ферментом, для которого выяснена его трехфрагментная структура . Представление об аналогичном строении ТПО как раз и базируется на структуре кристаллов МПО. Вторичная структура ТПО преимущественно состоит из a-спирали и в меньшей степени — из b-пластины .
Простетическая группа в каталитическом участке ТПО, содержащая гем, является производным ферропротопорфирина IX . В геме ТПО железо находится в форме FeIII. Оно реагирует с перекисью водорода (Н2О2), в результате чего образуется соединение I, содержащие на 2 электрона больше, чем ТПО в исходном состоянии. Два электрона переносятся с железа, в результате чего образуется оксиферрил (FeIV = 0) гем, а также с порфирина, в результате чего образуется порфирин-р-катион радикал. Гем связывает участок в центре основной части белка, где, так же как и в МПО и ЛПО, бис-гидроксилированный гем b ковалентно связан при помощи эфирных мостиков с остатками Glu 399 и Asp 238 . Проксимальными лигандами гема ТПО являются His 494 и Asn 579 (необходимы для достижения редокс-потенциала железа), а дистальными — His 239, Arg 396 и Gln 235 . Предполагается, что связи белка и гема формируются за счет механизма внутреннего процессинга. Ферментативно очищенная активная человеческая ТПО по данным электрофореза в SDS-полиактиламидном геле формирует плотно расположенные дублеты размером 105-110 кДа . ТПО, синтезируемая на полисомах, поступает в эндоплазматический ретикулум, где происходит гликозилирование белкового ядра молекулы, после чего созревание фермента заканчивается в аппарате Гольджи.
Большая часть фермента обнаруживается на перинуклеарной мембране, в эндоплазматическом ретикулуме и во внутриклеточных везикулах. Этот пул внутриклеточной ТПО преимущественно имеет неправильную пространственную структуру и быстро распадается . Созревшая, с правильной структурой, ферментативно активная ТПО транспортируется к апикальному полюсу тироцитов. Там обнаруживается только 1,5-2 % от всей синтезированной ТПО .
Функция ТПО
ТПО является ключевым ферментом биосинтеза тиреоидных гормонов. Она катализирует две ферментативные реакции: йодирование остатков тирозина в тиреоглобулине (ТГ) и окислительное связывание моно- и дийодтирозинов с образованием Т4 и Т3, связанных с ТГ . Этот процесс происходит в области апикального полюса тироцитов, который обращен к просвету фолликула, где помимо этого локализуются и другие ферменты, вовлеченные в биосинтез тиреоидных гормонов . Эти отдельные, но одновременно катализируемые реакции не специфичны для ТПО, а характерны и для пероксидаз животных, таких как ЛПО и МПО .
Для энзиматических реакций, осуществляемых ТПО, необходимы йод, Н2О2 и ТГ. Для того чтобы воздействовать как йодирующий агент, йодид, аккумулирующийся в тиреоците, в начале должен быть окислен. Эта реакция катализируется ТПО в присутствии Н2О2. Перекись водорода генерируется у апикального полюса тироцитов двойными оксидазами 1 и 2 (DUOX 1/2) — ферментами, принадлежащими к семейству НАДФ-Н оксидаз, которым необходимы НАДФ-Н и Са2+ .
Предполагается три возможных механизма, по которым осуществляется йодирование, катализируемое ТПО: свободнорадикальный механизм, ТПО-I+ — как промежуточный продукт или промежуточное йодирование с образованием гипойодита . В последнем случае железо гема, входящего в ТПО, выступает в окисленной форме (ТПО-FeIII). FeIII окисляется Н2О2 с образованием каталитического промежуточного соединения I (Ep+.-FeIV = O порфирин-p-катион), содержащего оксиферрил-гем, и по сравнению с нативным ферментом — два дополнительных окислительных эквивалента . Соединение I катализирует окисление двух электронов йодида с образованием ферментсвязанного гипойодида (E-OI-), который йодирует остатки тирозина в тиреоглобулине до моно- и дийодтирозина (МИТ, ДИТ) .
Второй реакцией, катализируемой ТПО, является связывание остатков йодтирозина с образованием тиреоидных гормонов T4 (DIT-DIT) и T3 (MIT-DIT) . Эта реакция включается в окислительный этап и неокислительное связывание и этап декомпозиции . В соответствии с этой предполагаемой моделью окисление одного электрона остатков йодтирозина продуцирует заряд, в итоге обеспечивающий связывание радикалов йодтирозина с образованием комплекса ТГ-Т4. Образование Т4 и Т3 зависит от нативной трехмерной структуры ТГ, поскольку оно происходит в результате специфической конформации пептидов, являющихся акцепторами и донорами остатков йодтирозина . В результате реакции отщепления образуются тиреоидные гормоны и остатки дегидроаланина в донорских участках ТГ . Активная форма ТПО как для йодирования, так и для соединения йодтирозинов — наиболее вероятно p-катион I (ТПОp+ - FeIV = O).
Дефекты органификации йода, которые в тяжелых случаях приводят к гипотиреозу, могут быть результатом нарушения синтеза ТГ, синтеза ТПО или продукции Н2О2. Мутации гена ТПО, вероятно, являются одной из двух основных причин нарушения органификации йода. Редукция или полное отсутствие активности ТПО, которое может быть следствием снижения связывания гема или субстрата, а также неправильной локализации или подавления ферментативной активности, являются важными причинами врожденного гипотиреоза .
ТПО и аутоиммунные заболевания щитовидной железы
Аутоиммунные заболевания щитовидной железы являются наиболее распространенной органоспецифической аутоиммунной патологией, которая встречается примерно у 5 % населения во всем мире. К настоящему времени прошло уже 47 лет с тех пор, как были описаны антитела к антигену, отличающемуся от ТГ, — антигену микросомальной фракции ЩЖ . Несмотря на проведение ряда исследований, природа микросомального антигена оставалась неизвестной почти 30 лет. Спустя много лет, в 1985 году, были получены первые данные о том, что микросомальным антигеном является ТПО .
ТПО, экспрессирующаяся на поверхности тироцита, является одним из основных антигенов ЩЖ, при этом предполагается, что аутоиммунная патология ЩЖ развивается вследствие направленной на ТПО агрессии как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета.
Антитела к ТПО (АТ-ТПО) являются маркером АЗЩЖ. Они присутствуют в сыворотке у большинства пациентов с болезнью Грейвса (80 %), тиреоидитом Хашимото (более 90 %), послеродовым тиреоидитом (2/3); их распространенность среди лиц без нарушения функции ЩЖ достигает 26 % . АТ-ТПО преимущественно продуцируются В-лимфоцитами, инфильтрирующими ЩЖ, и их уровень отражает выраженность лимфоидной инфильтрации . Аутоиммунный ответ к ТПО поликлонален, и циркулирующие АТ-ТПО преимущественно относятся к субклассам IgG 1 и IgG 4 с легкими k-цепями; тем не менее у тех же пациентов были обнаружены IgG 2 и IgG 3 с l-цепями . ТПО и АТ-ТПО вовлечены в комплементзависимую цитотоксичность и антителзависимые клеточно-опосредованные механизмы цитотоксичности, включающие NK-клетки . Кроме того, было обнаружено, что ТПО может активировать каскад комплемента в несвязанном с антителами состоянии . Наряду с этим было показано, что некоторые АТ-ТПО могут in vitro связывать ТПО и подавлять ее ферментную активность, хотя эти данные весьма противоречивы . Недавно было высказано предположение, что для оказания эффектов АТ-ТПО необходимо участие FcR — рецептора иммуноглобулина, экспрессируемого тироцитами, который участвует в трансцитозе IgG сквозь эпителий . Аутоиммунные процессы в ЩЖ являются Т-лимфоцитзависимыми процессами. Эпитопы, которые распознаются Т-клетками,— короткие линейные пептиды, образующиеся при процессинге ТПО в антигенпрезентирующих клетках, которые после связывания с молекулами МНС II класса (CD4+ T-клетки) распознаются рецепторами Т-клеток. При использовании различных методов (синтетические пептиды, короткие пептиды бактериального происхождения) на молекуле ТПО, включая ее трансмембранный домен, были идентифицированы некоторые эпитопы для Т-клеток . Несмотря на то что речь идет преимущественно об экспериментальных данных, они имеют большое значение, поскольку конкретный эпитоп ТПО, который задействован при АЗЩЖ, остается до конца неизвестен. Кроме того, в целом необходимо еще выяснить роль Т-клеток в инициации АЗЩЖ. Специфические антитела могут видоизменять Т-клеточную реакцию на ТПО при помощи модулирования презентации различных пептидов для Т-клеток .
ТПО как антиген
Поликлональные АТ-ТПО, присутствующие в сыворотке крови пациентов с АЗЩЖ, реагируют с некоторыми эпитопами В-клеток, локализованными на поверхности ТПО. Первое отграничение эпитопов ТПО было сделано в сравнительном эксперименте с человеческими АТ?ТПО и мышиными моноклональными АТ-ТПО, распознававшими эпитопы, расположенные на четырех доменах ТПО: A, B, C и D . Эти пионерские исследования показали, что иммунодоминантный регион (ИДР) ТПО, распознаваемый антителами, ограничен участком, перекрывающим домены A и B . Этот вывод был сделан позднее после того, как были проведены исследования с моноклональными человеческими антителами в форме Fab-фрагментов, продуцируемых В-лимфоцитами, инфильтрировавшими ЩЖ при болезни Грейвса и тирео-идите Хашимото . Оба региона, распознававшиеся человеческими моноклональными антителами, представляли собой одни и те же домены А и В . Кроме того, незначительная часть линейно расположенных эпитопов, распознанных АТ-ТПО вне ИДР, включала домены С2 и С21 . Было показано, что большая часть эпитопов, которые распознаются АТ-ТПО, конформационны, то есть зависят от третичной пространственной структуры и правильности складчатости молекулы ТПО . Точная локализация и структура прерывистого ИДР молекулы ТПО пока не выяснена. Недавние достаточно убедительные данные свидетельствуют о том, что ИДР ТПО ограничен МПО-подобным доменом . Влияние конформации ИДР ТПО было продемонстрировано в эксперименте с использованием человеческого Fabs и поликлональных антител против пептидов, которые могут экспрессироваться на поверхности человеческой АТ-ТПО . Некоторые исследования идентифицировали фрагменты эпитопов ТПО и подтвердили переменчивую природу ИДР ТПО . Моделирование структуры ТПО на основании ее гомологии с МПО позволяет предсказать потенциальную поверхность антигенов ТПО. Так были идентифицированы пептиды, прилежащие к эпитопам, локализованным в МПО-подобных доменах ТПО: остатки 713-717, 599-617, 210-225, 353-363, 549-563 . Кроме того, было постулировано наличие в ИДР БКК-подобного и ЭРФ-подобного доменов . ЭРФ-подобная порция ТПО была исключена, тогда как БКК-подобный модуль, вероятно, влияет на ИДР лишь неспецифично . Недавние экспериментальные данные позволили предположить, что БКК-подобный модуль ТПО является одной из частей варьирующего ИДР ТПО . Фрагмент ТПО, участвующий в связывании АТ-ТПО, к настоящему времени идентифицирован (остатки 210-225, 353-363, 549-563, 599-617, 713-720 и 766-775) в доменах А и В ИДР, локализованных в МПО-подобном и БКК-подобном модулях. В целом эти данные свидетельствуют о прерывистой и сложной природе ИДР. В нативной структуре ТПО, МПО- и БКК-подобные модули, вероятно, расположены в близком соседстве, образуя поверхность, узнаваемую АТ-ТПО у большинства пациентов с АЗЩЖ. Изучение ИДР ТПО с использованием человеческих, мышиных и кроличьих антител позволило предположить, что ИДР (А и В) образует отдельный комплекс в молекуле ТПО, расположенный в области остатков 599-617, лежащий в МПО-подобном домене . Это свидетельствует о том, что складчатая структура молекулы ТПО имеет очень высокую плотность и генерирует отдельную высококонформационную иммунодоминантную поверхность, к которой образуются АТ-ТПО. Несмотря на это, БКК-подобный (содержащий остаток Tyr 772) и ЭРФ-подобный модули вместе с петлевым регионом ТПО, вероятно, имеют важное значение для формирования трехмерной пространственной структуры, необходимой для связывания с антителами. Считается, что соотношение различных АТ-ТПО, направленных против отдельных эпитопов ИДР, не отражается на функции ЩЖ, сохраняется постоянным на протяжении длительного времени и детерминировано генетически .
Заключение
ТПО является важнейшим ферментом, участвующим в биосинтезе гормонов ЩЖ, и важнейшим антигеном при ее аутоиммунных заболеваниях. АТ-ТПО являются наиболее значимым маркером аутоиммунных тиреопатий, тем не менее их роль в аутоиммунных процессах противоречива. В последние годы предпринималось много попыток идентификации и характеристики иммунодоминантного региона ТПО и последовательности аминокислотных остатков, которые контактируют с АТ-ТПО. Имеющиеся в настоящее время и ожидаемые в будущем данные об иммунодоминантном регионе ТПО могут в существенной мере помочь разработке подходов к модулированию иммунного ответа при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ.
Список литературы
1. Taurog A. Hormone synthesis: thyroid iodine metabolism // Werner and Ingbar’s. The Thyroid: a Fundamental Text / L.E. Braverman, R.D. Utiger (eds.). — 8th edn. — Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000.
2. Kimura S., Kotani T., McBride O.W. et al. Human thyroid peroxidase: complete protein sequence, chromosome mapping, and identification two alternately spliced mRNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. — 84. — 5555-9.
3. De Vijlder J.J., Dinsart C., Libert F. et al. Regional localization of the thyroid peroxidase to human chromosome 2pter-p12 // Cell. Genet.— 1988. — 47. — 170-2.
4. Damante G., Di Lauro R. Thyroid-specific gene // Biochеm. Biophys Acta. — 1994. — 1218. — 255-66.
5. Kambe F., Seo H. Thyroid-specific transcription factors // J. — 1997. — 44. — 775-84.
6. Zanelli E., Henry M., Charvet B., Malthiery Y. Evidence alternate splicing in the thyroperoxidase messenger patients with Graves’ disease // Biochem. Biophys. — 1990. — 17. — 735-41.
7. Ferrand M., Le Fourn V., Franc J.L. Increasing diversity thyroperoxidase generated by alternative splicing // 2003. — 278. — 3793-800.
8. Le Fourn V., Ferrand M., Franc J.L. Differential expression thyroperoxidase mRNA splice variants in human thyroid // Biochеm. Biophys. Acta. — 2004. — 1689. — 134-41.
9. Niccoli P., Fayadat L., Panneels V. et al. Thyroperoxidase in its alternatively spliced form (TPO2) enzymatically inactive and exhibits changes in intracellular processing and trafficking // J. Biol. Chem. — 1997. — 272. — 29487-92.
10. Niccoli-Sire P., Fayadat L., Siffroi-Fernandez S., Franc J.L. Alternatively spliced form of human thyroperoxidase, TPOzanelli: activity, intracellular trafficking, and hormonogenesis // Biochemistry. — 2001. — 40. — 2572-9.
11. Fayadat L., Niccoli-Sire P., Lanet J., Franc J.L. Role of intracellular trafficking of thyroperoxidase and involvement generated at the apical surface of thyroid cells in covalent heme binding // J. Biol. Chem. — 1999. — 274. — 10533-8.
12. Elisei R., Vassart G., Ludgate M. Demonstration of the alternatively spliced form of thyroid peroxidase normal thyroid // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 1991. — 72. — 700-2.
13. Gardas A., Lewartowska A., Sutton B.J. et al. Human thyroid peroxidase (TPO) isoforms, and TPO-2: analysis of protein expression in Graves’ tissue // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 1997. — 82. — 3752-7.
14. Kimura S., Ikeda-Saito M. Human myeloperoxidase peroxidase, two enzymes with separate and distinct physiological functions, are evolutionary related members gene family // Proteins. — 1988. — 3. — 113-20.
15. Johnson K.R., Nauseef W.M., Care A. et al. Characterization of cDNA clones for human myeloperoxidase: predicted amino acid sequence and evidence for multiple mRNA species // Nucleic. Acids Res. — 1987. — 15. — 2013-28.
16. Morishita K., Tsuchiya M., Asano S. et al. Chromosomal gene structure of human myeloperoxidase and regulation of its expression by granulocyte colony-stimulating factor // J. Biol. Chem. — 1987. — 262. — 15208-13.
17. Dull T.J., Uyeda C., Strosberg A.D. et al. Molecular cloning of cDNAs encoding bovine and human lactoperoxidase // DNA Cell.
Biol. — 1990. — 9. — 499-509.
18. Kiser C., Caterina C.K., Engler J.A. et al. Cloning and sequence analysis of the human salivary peroxidase-encoding cDNA // Gene. — 1996. — 173. — 261-4.
19. Sakamaki K., Tomonaga M., Tsukui K., Nagata S. Molecular cloning and characterization of a chromosomal gene for human eosinophil peroxidase // J. Biol. Chem. — 1989. — 264. — 16828-36.
20. Daiyasu H., Toh H. Molecular evolution of the myeloperoxidase family // J. Mol. Evol. — 2000. — 51. — 433-5.
21. Magnusson R.P., Gestautas J., Seto P. et al. Isolation and characterization of a cDNA clone for porcine thyroid peroxidase // FEBS Lett. — 1986. — 208. — 391-6.
22. Libert F., Ruel J., Ludgate M. et al. Thyroperoxidase, an auto-antigen with a mosaic structure made of nuclear and mitochondrial gene molecules // EMBO J. — 1987. — 13. — 4193-6.
23. Derwahl M., Seto P., Rapoport B. Complete nucleotide sequence of the cDNA for thyroid peroxidase in FRTL5 rat thyroid cells // Nucleic. Acids Res. — 1989. — 17. — 8380.
24. Kotani T., Umeki K., Yamamoto I. et al. Nucleotide sequence of the cDNA encoding mouse thyroid peroxidase // Gene. — 1993. —
123. — 289-90.
25. Roitsch T., Lehle L. Structural requirement for protein glycosylation. Influence of acceptor peptides on cotranslational glycosylation of yeast invertase and site-directed mutagenesis around a sequon sequence // Eur. J. Biochem. — 1989. — 181. — 525-9.
26. Rawitch A.B., Pollock G., Yang S.X., Taurog A. Thyroid peroxidase glycosylation: the location and nature of the N-linked oligosaccharide units in porcine thyroid peroxidase // Arch. Biochem. Biophys. —
1992. — 297. — 32132-7.
27. Hobby P., Gardas A., Radomski R. et al. Identification of an immunodominant region recognized by human autoantibodies in a three-dimensional model of thyroid peroxidase // Endocrinology. — 2000. — 141. — 2018-26.
28. Gardas A., Sohi M.K., Sutton J. et al. Purification and crystallization of the autoantigen thyroid peroxidase from human Graves’ thyroid tissue // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1997. — 234. — 366-70.
29. Hendry E., Taylor G., Ziemnicka K. et al. Recombinant human thyroid peroxidase expressed in insect cells is soluble at high concentrations and forms diffracting crystals // J. Endocrinol. — 1999. — 160. — R13-R5.
30. Kimura S., Hong Y.S., Kotani T., Kikkawa F. Structure of the human thyroid peroxidase gene: Comparison and relationship to the human myeloperoxidase gene // Biochem. — 1989. — 28. — 4481-9.
31. Zeng J., Fenna R.E. X-ray crystal structure of canine myeloperoxidase at 3 A resolution // J. Mol. Biol. — 1992. — 226. — 185-207.
32. Fenna R., Zeng J., Davey C. Structure of the green heme in myeloperoxidase // Arch. Biochem. Biophys. — 1995. — 316. — 653-65.
Способ предусматривает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия. Отделяют балластные белки и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония 45-48% насыщения и 85-90% насыщения соответственно. Гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия. Хроматографическую очистку проводят на карбоксиметилцеллюлозе. Осуществляют лиофильную сушку целевой пероксидазы. Проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1. Осуществляют концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды. Способ позволяет получить пероксидазу с высокой удельной активностью и высоким выходом. Выход пероксидазы составляет 2,52-3,50 г/кг корней хрена, удельная активность - 640-700 Е.А./мг белка. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Рисунки к патенту РФ 2353652
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству ферментов из растительного сырья, и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства фермента пероксидазы из корней хрена для иммунологии и иммунохимии в качестве главной составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов.
Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена .
Известен способ получения пероксидазы из корней хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента солевым раствором, осаждение фермента солями сульфата аммония, гельфильтрацию, спиртовое осаждение, электрофорез, переосаждение хлоридом аммония, фильтрацию через сефадекс G-50 и ДЭАЭ-целлюлозу и диализ .
Основными недостатками данного способа являются невысокая активность и чистота полученного продукта, а также сложность его получения и большое количество стадий технологического процесса.
Известен также способ получения пероксидазы из корней хрена, по которому корни хрена гомогенизируют, затем экстрагируют фермент водой и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония с последующей гельфильтрацией [Пат. Венгрии 172872, C07G 7/022].
Недостатком данного способа является низкий выход и низкая чистота фермента.
Известен способ [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90], по которому корни хрена проращивают в течение 2-3 суток, затем гомогенизируют и экстрагируют фермент водой в течение суток. Водный экстракт центрифугируют с последующим фракционированием белков солями сульфата аммония, затем сульфатаммонийный осадок фермента растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации на фильтрах "Милипор" PTGC 000 05. К полученному фильтрату прибавляют 0,5 М фосфатный буфер (рН 8) в соотношении 100 частей буфера на 1 часть фильтрата и пропускают через колонку с ионообменником ДЭАЭ-Сефадекс А-50, затем последовательно ультрафильтруют на "Милипор" PTGC 000 05, РТНК 000 05, PTGC 000 05 и подвергают лиофильной сушке.
Недостатком данного метода является недостаточно высокий выход пероксидазы, высокая трудоемкость и длительность процесса.
Наиболее близким является способ [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999], в котором промытые водой корни хрена зачищают на 1/3 массы в присутствии 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, используемого в качестве экстрагирующего раствора. Пероксидазу из очисток экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором аскорбиновой кислоты, затем экстракт фильтруют и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют 5% сульфита натрия и выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре для "созревания" фермента. "Созревший" раствор фермента концентрируют на ультрафильтрационных волоконных аппаратах с фильтрами, имеющими диаметр пор менее 40 кДа. К сконцентрированному в 10 раз раствору добавляют сульфат аммония до конечного насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в десятикратном объеме бидистиллированной воды и наносят на колонку, заполненную сефадексом G-25, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу с величиной R Z >0,1. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу, с величиной R Z >0,5. Фракции смешивают, дотитровывают до рН 4,4 и подвергают очистке на карбоксиметилцеллюлозе, фермент элюируют в градиенте концентраций от 5 мМ до 0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4) (V=S-500 мл, R-500 мл). Собирают фракции с величиной R Z >2,7 и с концентрацией фермента не менее 10 мг/мл. Фракции объединяют, дотитровывают до рН 5,0 и лиофильно высушивают.
Недостатками данного метода являются недостаточно высокая чистота и активность и небольшие выходы пероксидазы.
Изобретение решает задачу создания промышленного способа получения пероксидазы из корней хрена, позволяющего получать пероксидазу с высокой чистотой, с высокой удельной активностью и с высоким выходом.
Поставленная задача решается способом получения фермента пероксидазы из корней хрена, который включает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, при этом измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1 и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.
Дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение,
Хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.
Лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.
На Фиг.1 приведена принципиальная схема выделения пероксидазы из корней хрена.
Корни хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщенные корни измельчают и экстрагируют 0,15 М раствором хлорида натрия в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.
К супернатанту-1 (Фиг.1) при непрерывном перемешивании добавляют 16,7±0,05 кг (45-48% насыщения) сульфата аммония, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а к образовавшемуся супернатанту-2 (Фиг.1) добавляют еще 11,8±0,05 кг (85% насыщения) сульфата аммония, осадок (Фиг.1) отделяют центрифугированием и растворяют дистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл. После центрифугирования супернатант, содержащий пероксидазу, наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100, и элюируют 0,15 М раствором хлорида натрия со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют и диализуют против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (буфер-1), затем обессоленный раствор пероксидазы наслаивают на колонку, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1, и элюируют линейным градиентом 5 мМ - 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют и диализуют против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2), отдиализованный раствор фермента наслаивают на колонку, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, и элюируют буфером-2. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют и диализуют против деионизованной воды, затем переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.
Существенными отличительными признаками предлагаемого способа получения биологически активных веществ являются:
Использование гельфильтрации на сефадексе G-100 для максимально полной очистки пероксидазы от низкомолекулярных примесей;
Диализ против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0), позволяющий обессолить раствор пероксидазы и подготовить его к хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе;
Диализ против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1), позволяющий перевести раствор пероксидазы в оптимальный буфер с оптимальным рН для нанесения на ДЭАЭ-целлюлозу;
Ионообменная хроматография пероксидазы на ДЭАЭ-целлюлозе как прием, обеспечивающий не только дополнительную очистку, но и концентрирование раствора фермента.
Таким образом, нами предлагается новый подход, позволяющий осуществлять переработку корней хрена с получением фермента пероксидазы высокой чистоты и удельной активности.
Отличие заявляемого способа от ближайшего аналога и прототипа состоит в следующем.
В заявляемом способе измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2, тем самым достигается максимально полный переход фермента в раствор, и при этом фермент не теряет своей активности.
В аналоге изобретения [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999] пероксидазу из очисток (без гомогенизации!) экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором пищевой аскорбиновой кислоты, что может сказываться на выходе пероксидазы, поскольку очистки не гомогенизируются, а следовательно, фермент переходит в раствор далеко не полностью, при этом экстракция протекает в кислых условиях, что может привести к частичной инактивации фермента. В прототипе изобретения [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90] фермент из гомогенизата корней хрена экстрагируют водой, что также приводит к низкому выходу пероксидазы из гомогенизата в раствор.
В отличие от аналога изобретения, где пероксидазу осаждают дважды 85-90% насыщением сульфатом аммония, и прототипа изобретения, где четыре раза проводят осаждение белков солями сульфата аммония, в заявляемом способе проводят отделение балластных белков 45-48% насыщением, а затем осаждают пероксидазу 85% насыщением.
В аналоге и прототипе изобретения концентрирование проводят методом ультрафильтрации, при этом в аналоге изобретения ультрафильтрация предшествует сульфатаммонийному осаждению пероксидазы, что приводит к большой вероятности соосаждения примесных белков, а соответственно, к более низкой чистоте конечного продукта. В заявляемом способе пероксидаза подвергается концентрированию на ионообменном сорбенте ДЭАЭ-целлюлоза на заключительной стадии технологического процесса, что приводит и к дополнительной очистке фермента.
В заявляемом способе гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0), что позволяет полностью избавиться от зеленоватого оттенка раствора пероксидазы, обусловленного наличием хлорофилла и родственных соединений, и веществ с меньшим, чем у пероксидазы, размером молекул. В аналоге изобретения гельфильтрацию проводят на сефадексе G-25, который по способности задерживать примесные частицы, учитывая размер молекулы пероксидазы (около 40 кДа), уступает сефадексу G-100.
Сущность изобретения иллюстрируется следующим примерами.
Пример 1. Получение грубого экстракта
50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщеные корни измельчают на лопастном гомогенизаторе и заливают 50 л 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4±0,2). Суспензию экстрагируют в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.
К супернатанту-1 объемом 60 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. (Под 100%-ным насыщением имеется в виду количество соли, при добавлении которого раствор становится насыщенным, а при дальнейшем добавлении соли раствор становится пересыщенным, и соль выпадает в осадок. Для растворов с сульфатом аммония 100% насыщением является добавление и полное растворение 70,7 г сульфата аммония в 100 мл дистиллированной воды.) Осадок-1 отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант-2 объемом 55 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок-2 отделяют центрифугированием. Образовавшийся осадок-2 растворяют деионизованной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок-3 отделяют центрифугированием.
Гель-хроматография на сефадексе G-100.
Раствор пероксидазы наносят на колонку объемом 1 л, заполненную сефадексом G-100. Элюцию ведут 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0) со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют.
В сборник помещают 5 л 5±0,1 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0) (буфер-1) и диализный мешок с объединенными фракциями пероксидазы. Диализ ведут при постоянном перемешивании в течение 24 ч, трижды меняя буфер в сборнике.
Обессоленный раствор фермента наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1. Элюцию ведут со скоростью 50 мл/ч в линейном градиенте 5 мМ-0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют.
В сборник помещают 5 л 20±0,1 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2) и диализный мешок с объединенными фракциями фермента. Диализ ведут аналогично.
Концентрирующая хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.
Раствор фермента с рН 8,0±0,1 наслаивают на колонку объемом 300 мл, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию ведут буфером-2 со скоростью 50 мл/ч. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют.
В сборник помещают 5 л деионизованной воды и диализный мешок с раствором пероксидазы. Диализ ведут аналогично.
Лиофильная сушка.
Раствор пероксидазы переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.
Пример 2 (сравнительный)
В данном примере выдержаны условия получения пероксидазы по прототипу, но для улучшения основных показателей пероксидазы изменены две существующие в прототипе стадии, а именно: для ультрафильтрационного концентрирования раствора пероксидазы используют два типа колонок с полыми волокнами, в отличие от прототипа, где используют один тип волокон, и дробное фракционирование белков солями сульфата аммония (как в заявляемом способе).
Получение грубого экстракта.
50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и зачищают на 1/3 часть массы в присутствии 33,5 л 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, в котором полученные очистки выдерживают в течение 1 ч для экстракции фермента пероксидазы. Далее экстракт центрифугируют на проточной центрифуге и выдерживают в течение 24 ч для "созревания" фермента.
Первичная очистка и концентрирование.
В полученный экстракт добавляют 1,7 кг (5% по весу) сульфита натрия и экстракт подвергают концентрированию и первичной очистке методом ультрафильтрации на установке с полыми полимерными волокнами УПВ-6, укомплектованной колонками с фильтрами, имеющими размеры пор 60 кДа и 5 кДа. Принципиальная схема установки представлена на Фиг.2, где показаны центробежный насос 1; предфильтр 2; колонка с волокнами, имеющими размер пор 60 кДа 3; колонка с волокнами, имеющими размер пор 5 кДа 4; фильтрат пероксидазы 5; концентрированный раствор пероксидазы 6; фильтрат, содержащий низкомолекулярные белки 7.
Фракционирование белков солями сульфата аммония.
К концентрату объемом 6 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант объемом 5,7 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок отделяют центрифугированием, который растворяют бидистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием.
Гель-хроматография на сефадексе G-25 и G-50.
Дальнейшую очистку пероксидазы проводят на колонке для гельфильтрации, заполненной сефадексом G-25 и уравновешенной бидистиллированной водой. Раствор пероксидазы наносят на колонку, элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,2. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до 90% насыщения, перемешивают до полного растворения соли и центрифугируют. Осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50 и уравновешенную бидистиллированной водой. Элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,6. С помощью 50% уксусной кислоты значение рН во фракциях с пероксидазой устанавливают на уровне 4,4.
Хроматография на карбоксиметилцеллюлозе.
Фракции пероксидазы наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой, предварительно уравновешенную 5 мМ ацетатным буфером с рН 4,4. Элюирование проводят линейным градиентом 5 мМ-0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л) в течение 1 часа. В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,7, объединяют, устанавливают рН 5,0 добавлением аммиака и лиофильно высушивают.
Сравнительные данные по примеру 1 и 2 приведены в таблице.
| Таблица Сравнительные данные основных параметров качества пероксидазы из корней хрена при использовании двух способов получения. |
||
| Наименование технологического параметра, единицы измерения. | Пример 1 (заявляемый способ) | Пример 2 (известный способ) |
| Выход по массе пероксидазы, г/кг корней хрена. | 2,52-3,50 | 0,21-0,85 |
| Удельная активность препарата, Е.А./мг белка* | 640-700 | 560-610 |
| Чистота по спектрофотометру R Z =D 408 /D 275 | 3,00-3,20 | 2,70-3,00 |
| * - Удельная активность вычислялась с использованием данных, приведенных в работе СТП 103.34-83. Правила вычисления и обработки результатов количественного анализа. НИКТИ БАВ, 1983. |
Таким образом, как видно из примеров и таблицы, заявляемый способ получения пероксидазы из корней хрена (пример 1) позволяет получать пероксидазу с высокими выходами, с чистотой и активностью, достаточной для использования данного фермента в качестве составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов. А в условиях прототипа (пример 2) даже при усовершенствовании двух стадий, улучшающих показатели, выход, удельная активность и чистота целевой пероксидазы ниже аналогичных показателей заявляемого способа.
Данный способ может быть использован в промышленном получении пероксидазы из корней хрена.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена, включающий размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1, и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН 4,4±0,2.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.
Пероксидазы катализируют окисление субстратов за счет перекиси водорода. Пероксидазной активностью обладают только аэробные илы. Анаэробные илы лишены пероксидазной активности.[ ...]
Пероксидаза сердечной мышцы леща кодируется одним генетическим локусом с тремя кодоминантными аллелями; По79» По108 По11 , обуславливающими формирование соответственно 3 гомозиготных и 3 гетерозиготных фенотипов генотипе»).[ ...]
Пероксидаза действует на фенолы и ароматические амины: пирогаллол, гидрохинон, пирокатехин, ортокрезол и др.[ ...]
Активность пероксидазы выражается количеством гваякола, который окисляется Н2О2 под влиянием пероксидазы 0,001 мл крови. Для этого экстинцию опытной пробы переводят согласно калибровочной кривой в количество гамм пероксидазы, делят на четыре (разведение крови для ры6 около 1:250) и на 30 млн. (время инкубирования) и выражают активность пероксидазы в гваякольных единицах на минуту.[ ...]
Полифенолазы и пероксидазы катализируют окисление фенольных соединений. В присутствии этих ферментов различные фенолы окисляются в дифенолы, полифенолы и хиноны. Биохимическое значение этих ферментов в том, что они могут включаться в биологические системы в качестве переносчиков водорода и, таким образом, принимать участие в процессах окисления различных субстратов. Фермент подобного типа, например аскорбат-оксидаза, катализирует окисление аскорбиновой кислоты в присутствии кислорода, где участие фенольных соединений как раз оказывает влияние на ход окисления.[ ...]
При отсутствии пероксидазы можно пользоваться шкалой, составленной на пероксидазе растительного происхождения с содержанием в мл 25 гамм. Использовали колориметр марки ФЭК56-2.[ ...]
ФХ-фитохром; ПО - пероксидаза; КАФ - кроличья антисыворотка к фитохрому; БАС - баранья антисыворотка к иммуноглобулину кролика; КАП - кроличьи антитела к пероксидазе.[ ...]
Вводные пояснения. Пероксидаза - фермент, катализирующий окисление полифенолов и некоторых ароматических аминов при помощи кислорода, перекиси водорода или органических перекисей. Пероксидаза образует с перекисью водорода комплексное соединение, в результате чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода.[ ...]
Полифенолоксидаза и пероксидаза - им в почвах принадлежит важная роль в процессах гумусообразования. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. При этом ее роль состоит в активировании перекисей, поскольку они обладают слабым окисляющим действием на фенолы. Далее может происходить конденсация хи-нонов с аминокислотами и пептидами с образованием первичной молекулы гуминовой кислоты, которая в дальнейшем способна усложняться за счет повторных конденсаций (Кононова, 1963).[ ...]
Полифенолоксидаза и пероксидаза являются конечными оксидазами и характеризуют интенсивность заключительной фазы дыхания. Согласно имеющимся представлениям, оксидазная фаза дыхания включает в себя акт соединения водорода с молекулярным кислородом. Под влиянием различных факторов воздействия, в том числе различных элементов минерального питания, наблюдаются изменения данной фазы дыхания. Активирование оксидазной фазы дыхания влечет за собой быстрое и необратимое окисление дыхательных хромогенов-полифенолов и резкие нарушения нормальной жизнедеятельности тканей. В клеточном соке растений находятся как полифенолы, подвергающиеся окислению, так и полифенолоксидазы, оказывающие каталитическое действие на окисление этих соединений. Обычно в растении имеется достаточное количество водорода, что препятствует окислению полифенолов.[ ...]
Приведенные данные показывают, что пероксидаза - чувствительный индикатор, регистрирующий изменения в газообмене, и может быть использована для экспресс-диагностики отравления рыб.[ ...]
Таким образом, повышение активности пероксидазы в десятикилометровой зоне А ГПЗ позволяет предположить присутствие в атмосфере этого района углеводородов ароматического ряда. Показатель pH не выявил каких- либо реакций растений на загрязнение внешней среды. Буферная способность клеток растений изменяется в течение всего вегетационного периода и характеризует естественный рост и развитие.[ ...]
Опыты Манской /32/, исследовавшей ферменты пероксидазу и фенолоксидазу камбия при образовании древесины сосны, также указывают на действие этих ферментов на кониферин (гликозид кони- ферилового спирта). Пероксидаза и дегидрогеназа клеток лыка Araucaria excelsa превращают конифериловый спирт в аморфный дегидрогенизированный полимер, имеющий свойства лигнина /33/.[ ...]
Рассмотрено распределение аллелей локуса пероксидазы в нерестовом скоплении леща в районе р. Сить Рыбинского водохранилища. Проведена оценка популяционно-генетических процессов.[ ...]
Слынько Ю. В. Распределение генотипов локуса пероксидазы сердечной мышцы у леща двух нерестовых групп.[ ...]
Лероксидаза (Донор: Н2Огоксидоредукта а. КФ 1.11.17) Пероксидаза участвует в реакции конденсации веществ при образовании молекул гуминовых кислот, принимает участие в окисли-тельно-восстановительных процессах в почве.[ ...]
Установлено, что МФК вызывала усиление активности пероксидазы. Отмечали достоверное увеличение активности пероксидазы в листьях ячменя под действием МФК (0.001 и 0.01 моль/л). Активацию пероксидазы в листьях пелюшки в 1.7-2.2 раза вызывала МФК в концентрациях (0.1, 0.01, 0.001 моль/л).[ ...]
Для обесцвечивания сточных вод могут быть также применены энзимы пероксидазы и fungal laccase. Кроме белой плесени актиномшдитные бактерии с дехлорирующей активностью могут также найти применение для обработки отбеливающих стоков целлюлозно-бумажных производств.[ ...]
Техника определения на ФЭК та же, что и при определении активности пероксидазы. В две кюветы толщиной 2 см вносят по 2 мл вытяжки, 2 мл воды или буферного раствора, 2 мл раствора парафенилеидиамина в каждую. Обе кюветы ставят на ФЭК. Уравнивают световые потоки. При этом стрелка гальванометра стоит на нуле. Отсчетный правый барабан переводят на 0,250 деление оптической плотности. Определение ведут при желто-зеленом светофильтре.[ ...]
Установлено, что активность таких ферментов как полифенолоксидаза, пероксидаза, дегидрогеназа изолимонной кислоты под влиянием марганца повышается. При этом марганец принимает участие в составе просте-тической группы ферментов. Поэтому есть основание рассматривать марганец как биокатализатор, принимающий участие прежде всего в превращении азотистых соединений. Таким образом, рассмотрение роли марганца в связи с азотным метаболизмом является наиболее интересным с теоретической и практической стороны.[ ...]
Цинк входит также в состав других ферментов - трио-зофосфатдегидрогеназы, пероксидазы, каталазы, оксидазы, полифенолоксидазы и др.[ ...]
Изучение леща в пределах его ареала позволило нам ранее выявить полиморфный локус пероксидазы сердечной мышцы и установить клинальный характер распределения частот аллелей по широте и их независимость от пола и возраста . В дальнейшем в ходе направленных индивидуальных скрещиваний была подтверждена справедливость гипотезы ген-аллельной детерминации и в ряде экспериментов - селективная значимость аллелей и генотипов данного локуса.[ ...]
Подобные изменения обнаружены и в ходе онтогенеза фотопериодически нейтральных видов (рис. 142). Это сходство указывает па несомненную причастность найденных изменений метаболизма к регуляции цветения нейтральных видов как в связи с возрастом, так и с физиологическим градиентом цветения.[ ...]
При изменении градиента цветеиия с помощью кольцевания и создания обратного градиента цветеиия меняется противоположным образом и градиент распределения фитогормоиов.[ ...]
Мы в своих исследованиях изучали состояние ферментных систем, в частности дыхательного фермента пероксидазы, и установили, что этот феномен позволяет быстро регистрировать изменения в газообмене под влиянием различных токсических веществ.[ ...]
Медь участвует в углеводном и белковом обмене в растениях. Под влиянием меди повышается как активность пероксидазы, так и синтез белков, углеводов и жиров. Недостаток меди вызывает у растений понижение активности синтетических процессов и ведет к накоплению растворимых углеводов, аминокислот и других продуктов распада сложных органических веществ.[ ...]
Из полученных данных можно сделать вывод, что в ранний период жизни растений количественно преобладает пероксидаза, а по мере старения активность ее падает, но возрастает активность полифенолоксидазы. Марганец повышает активность этих ферментов.[ ...]
Результаты отражают изменение оптической плотности за 1 с на 1 г сырой массы ткани. Определяют активность пероксидазы в листьях верхнего и нижнего ярусов или -в проростках злаков, выращенных в разных условиях. Результаты опыта записывают но форме (табл. 30).[ ...]
Целью работы было изучить влияние фосфорорганического ксенобиотика - метилфосфоновой кислоты на активность пероксидазы и перекис-ное окисление липидов. Опыты проводили в полевых условиях. Культурные и дикорастущие растения однократно опрыскивали растворами метилфосфоновой кислоты (МФК). Активность пероксидазы определяли по Михлину (Ермаков и др., 1952) на 4 день после обработки.[ ...]
В этих интервалах наблюдались максимальные изменения в анатомическом строении, максимальное увеличение активности пероксидазы, почти полное исчезновение сахаров в парен- химе коры в вариантах 2,4-Д и 2,3,6-ТБ (во флоэме содержание сахаров оставалось почти таким же, как в контроле) и увеличение содержания свободных аминокислот. В корнях на расстоянии более 20 см активность пероксидазы и содержание сахаров почти приблизились к контролю.[ ...]
Нами использована более точная и простая методика определения пероксидазной активности крови - метод Баха и Зубковой. Принцип методики заключается в том, что перекись водорода в присутствии пероксидазы разлагает растворенный в воде гваякол. Продукты окисления гваякола определяются колориметрически. По их количеству судят об активности фермента.[ ...]
В пашей совместной работе с Л. И. Сергеевой, Т. И. Константиновой и Н. П. Аксеновой [Сергеева и др., 1984] ташке выявлено наличие по стеблю табака Трапезопд биохимического градиента активности ферментов пероксидазы и полифенолоксидазы. Оказалось, что активность пероксидазы увеличивается, а активность полифенолоксидазы уменьшается в акропетальиом направлении в коре стебля. Подобные изменения активности изученных ферментов обнаружены и в ходе онтогенеза по мере приближения растений к цветению.[ ...]
В условиях промышленного загрязнения атмосферы обнаружено усиление аэробного дыхания и возрастание активности терминальных оксидаз. Для растений, произрастающих на промплощадке, характерна максимальная активность пероксидазы и полифенолоксидазы. Уровень активности и чувствительности ферментов зависит от биологических особенностей и степени повреждаемости вида. Максимальная активность и чувствительность пероксидазы и полифенолоксидазы к действию газов отмечалась у березы бородавчатой, средняя -у тополя бальзамического и самая низкая - у клена ясенелистного.[ ...]
Нижние границы определяемых концентраций ртути 0.01, 0.05 и 0.0001 мкг/л соответственно . Метод характеризуется не только высокой чувствительностью, но и селективностью - определению ртути мешают только 10-кратные избытки кадмия и висмута. Кроме того, он отличается экспрессностью (15 мин), простотой и дешевизной. Дальнейшее развитие позволило адаптировать его для определения ртути в природных водах с высоким содержанием железа (> 1 мг/л) и сократить время инкубирования. Минимальная определяемая концентрация ртути 0.01 мкг/л . Более простой модификацией метода является тест-методика для определения ртути по ее ингибирующему действию на пероксидазу, иммобилизованную на хроматографические бумаги, с наименьшими определяемыми концентрациями ртути 0.01-0.04 мкг/л . ПО аналогичной методики равен 5-10 нг/л . Применение индикаторных бумаг на основе иммобилизованных на них ферментов имеет ряд очевидных преимуществ, упрощающих процедуру определения ртути в различных объектах.[ ...]
Иммуноферментный метод диагностики вирусных болезней относится к числу перспективных. Этот метод является усложненной модификацией серологического анализа. Сущность его заключается в следующем: на стадии выделения иммуноглобулинов добавляют небольшое количество фермента пероксидазы или кислой фосфата-зы, что позволяет резко повысить чувствительность метода благодаря цветной реакции. При этом дается не только качественная характеристика, но и количественная. В настоящее время освоены методы получения конъюгата (иммуноглобулины, меченные указанными выше ферментами) для выявления вирусов X, У, 3, М. Однако длительность анализа (до двух дней), трудность получения конъюгата и дефицит высококачественных полистироловых плашек ограничивают применение этого метода. Его обычно используют при оздоровлении сортов картофеля. Вначале меристемный материал проверяют с помощью капельного серологического, индикаторного и других методов и только после этого для окончательной проверки используют иммуноферментный метод.[ ...]
Так, оказалось, что если у цветущих растений удалить верхнюю половину стебля до 9-12-го узла снизу, то вновь регенерирующие па этих узлах почки зацветают заметно быстрее, чем соответствующая почка па целом растении (рис. 141). В то же время удаление верхней части стебля приводит к понижению активности пероксидазы и повышению активности полифенолоксидазы в оставшейся нижней части стебля (табл. 5). Эти опыты указывают иа то, что как физиологический градиент цветения, так и биохимический градиент активности ферментов основаны на одних и тех же взаимодействиях верхних и нижних участков стебля в системе целостного растения.[ ...]
Ранее нами было выявлено, что предобработка проростков пшеницы салициловой кислотой (СК) оказывает предадаптирующий эффект на растения к последующему воздействию засоления. В спектре защитного действия СК важное место занимает ее эффект на транзитное усиление продукции активных форм кислорода (АФК) и активацию супероксиддисмута-зы и пероксидазы в корнях. В условиях же засоления СК способствовала снижению резкой стресс-индуцированной продукции АФК и, соответственно, активности антиоксидантных ферментов (Сахабутдинова, Фархутдино-ва, Шакирова, 2004). Одним из механизмов защиты растений от действия стрессовых факторов является укрепление барьерных свойств клеток. Важную роль в лигнификации клеточных стенок играют фенилаланиниамми-ак-лиазы (ФАП), анионная пероксидаза и АФК. Показано, что предобработка проростков пшеницы СК способствовала ускорению образования лигнина в корнях при воздействии 2% NaCI по сравнению с СК-необрабо-танными растениями. Интересно, что сама обработка СК также ускоряла лигнификацию клеток пучков ксилемы, вероятно, за счет повышения активности ФАП и содержания анионной пероксидазы. Образование лигнина в клетках корней в предобработайных СК растениях является важным механизмом защиты к засолению, о чем свидетельствуют данные по снижению уровня пероксидации липидов и выхода электролитов из клеток обработанных СК проростков, что отражалось в существенном уменьшении степени ингибирующего действия 2% NaCI на рост растений пшеницы. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении ФАП и анионной пероксидазы, участвующей с привлечением АФК в образовании лигнина, в спектр защитного действия СК на растения пшеницы.[ ...]
Наивысшая активность большинства ферментов наблюдается у целлюлозоразрушающих грибов. У лигнинразрушающих грибов наряду с гидролитическими ферментами существуют также специфические ферменты - оксидазы. Очень много пероксидазы выделяют грибы из рода феллинус (РЬеШпив), особенно ложный трутовик (Р. igniarius). Грибная пероксидаза выделяется только вегетативным мицелием и не отмечена в плодовых телах.[ ...]
После каждой обработки гербицидами в листьях кукурузы на 2-3-ий, 8--10-ый и 18-20-ый день, а затем через каждые 20 дней, а у двудольных сорняков в первые дни после опрыскивания, проводились физиологические исследования. Одновременно велись наблюдения за морфологическими изменениями у культурных и сорных растений под действием гербицидных доз 2,4-Д и определение сухого веса одного растения-На делянках проводился учет сорных растений и определялась структура урожая.[ ...]
У других древесных пород окисляются таким же образом эллаготан- нины и флаванонолы, что вызывает пожелтение целлюлозы. Другим видом окисления полиоксифенолов является ферментативное окисление, особенно при действии пероксидаз и фенолаз. Ферментативно предпочтительнее окисляются соединения с низким окислительновосстановительным потенциалом, так как образующиеся хиноны реагируют в первую очередь друг с другом или соответственно с хи-нонами, имеющими такой же окислительно-восстановительный потенциал. Вещества с высоким окислительно-восстановительным потенциалом остаются незатронутыми; например, галловая кислота сама по себе не окисляется оксидазой чая, но в присутствии кате- хинов легко подвергается окислительной димеризашш.[ ...]
Технология отбелки с использованием энзимов относительно новая, и механизм действия энзимов точно не установлен. Основным преимуществом товарных ксиланаз является снижение расхода белящих реагентов при отбелке целлюлозы до высокого уровня белизны, относительно низкая стоимость энзимов, простота применения и высокая селективность их действия.[ ...]
В случае механизма Бриггса - Холдейна, для которого ¿2» к-1, отношение Ис /Км равно к - константе скорости связывания фермента и субстрата. Еще одним ферментом такого типа является пероксидаза, выделенная из хрена,- один из первых ферментов, к которому были применены методы исследования быстрых реакций . Сначала пероксидаза образует с перекисью водорода компекс Михаэлиса, который затем взаимодействует с донором водорода (реакция второго порядка). При достаточно высоких концентрациях донора скорость второй реакции значительно превышает скорость диссоциации комплекса Михаэлиса.[ ...]
Другой постулат рассматриваемой гипотезы - это то, что способность к синтезу белка остается относительно неизменной во время старения листа. Удобным методом измерения скорости синтеза белка является определение скорости включения радиоактивных аминокислот, таких, как 14С-лейцин, в белок. Аналогичным образом можно определить скорость синтеза РНК по скорости включения предшественника РНК, такого, как;14С-аденип. Данные, полученные с помощью этих методов, показали, что способность листьев табака включать 14С-лейцин и иС-адешш в процессе старения снижается, хотя довольно желтые листья сохраняют некоторую способность синтезировать определенные ферменты, такие, как пероксидазу и рибонуклеа-зу (вызывающие расщепление РНК). Однако это свидетельствует о том, что снижение способности к синтезу белка в большей степени является результатом, чем причиной старения. Тем не менее представляется очевидным, что метаболизм белка в стареющих, связанных с растением листьях может рассматриваться как несбалансированная реакция круговорота, где процессы катаболизма преобладают над процессами анаболизма.